第五节-培养基(medium)

第五节培养基(medium)定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。用途：促进微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）物理化学条件适宜（条件适宜）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）一、培养基的配制原则（一）培养基组分应适合微生物的营养特点即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；LB(Luria-Bertani)放线菌：高氏一号培养基真菌：查氏合成培养基；PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌；麦芽汁当对试验菌营养需求特点不清楚的时候，可以采用“生长谱”法进行测定。●浓度过高——微生物的生长起抑制作用，浓度过小——不能满足微生物生长的需要。●碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，常作为考察培养基组成时的一个重要指标；●速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例●各种金属离子间的比例碳源中的碳原子的mol数氮源中所含的氮原子的mol数C/N比值=例：谷氨酸生产中C/N＝4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N＝3/1时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。（二）营养物的浓度与比例应恰当（1）pH：各类微生物的最适生长pH值各不相同：细菌：7.0~8.0放线菌：7.5~8.5酵母菌：3.8~6.0霉菌：4.0~5.8在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液（三）物理化学条件适宜☆磷酸缓冲液：pH值从6.0~7.6之间K2HPO4+HClKH2PO4+KClKH2PO4+KOHK2HPO4+H2O☆加入CaCO3：CO32–HCO3–H2CO3CO2+H2O+H+–H–+H+–H–☆培养基中所含氨基酸、肽、蛋白质等物质也可起到缓冲作用。渗透压等渗溶液适宜微生物生长高渗溶液细胞发生质壁分离低渗溶液细胞吸水膨胀，直至破裂大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有的菌如Staphylococcusaureus则能在3mol/LNaCl的高渗溶液中生长。能在高盐环境（2.8~6.2/LNaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。（2）渗透压和awaw：水分活度（wateractivity）各种微生物生长的水分活度：0.6~0.99之间aw=PP0细菌酵母菌霉菌微生物生长的最低aw一般：0.90~0.98嗜盐菌：0.75（约5.5mol/LNaCl）一般：0.87~0.91高渗酵母：0.61~0.65（饱和蔗糖液）Saccharomycesrouxii(鲁氏酵母)：0.60一般：0.80~0.87耐旱菌：0.65~0.75Xeromycesbisporus（双孢旱霉）：0.60各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求：好氧微生物：+0.3~+0.4V,(在0.1V以上的环境中均能生长)。厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长。兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵。培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度。培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。（3）氧化还原电势(redoxpoyential)该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？☆用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）；☆用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物；（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源1.生态模拟：调查所培养菌的生态条件，查看“嗜好”，对“症”下料——初级天然培养基。2.查阅文献：查阅、分析文献，调查前人的工作资料，借鉴人家的经验，以便从中得到启发设计有自己特色的培养基配方。3.精心设计：借助优选法或正交试验设计法等方法。二、设计培养基的方法☆当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉的原料，提倡以粗代精，以废代好。4、实验比较：不同培养基配方的选择比较单种成分来源和数量的比较几种成分浓度比例调配的比较小型试验放大到大型生产条件的比较pH和温度试验◆附1：配置培养基时应注意的几个问题及解决方法：沉淀胶体强度的破坏褐色物质的形成pH发生变化高压蒸气灭菌：一般培养基：1.05Kg/cm2,121.3℃,15～30min。含糖培养基：0.56Kg/cm2,112.6℃,15～30min。干热空气灭菌：160℃，2h。过滤灭菌，分别灭菌，间歇灭附2：灭菌附图：过滤灭菌菌，紫外光，化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）的应用。三、培养基的类型其应用1.按对培养基成分的了解程度来分①天然培养基(complexmedium)：也称作chemicallyundefinedmedium。利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质（如肉汤、蛋白胨、麦芽汁、酵母汁、豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培养基，天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。②合成（组合）培养基(syntheticmedium)：也称作chemicallydefinedmedium.由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室范围内有关微生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。如高氏培养基、察氏培养基等。③半组合培养基(semi-definedmedium)：在合成培养基的基础上添加些天然成份，以更有效地满足微生物对营养物的需要，如马铃薯蔗糖培养基。①液体培养基(liquidmedium)：液体培养基不含任何凝固剂，菌体与培养基充分接触，操作方便，常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。可据培养后的浊度判断微生物的生长程度。②固体培养基(solidmedium)：天然固体营养基质制成的培养基，或液体培养基中加入一定量凝固剂（琼脂1.5～2%)而呈固体状态的培养基。为微生物的生长提供营养表面。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。可依使用目的不同而制成斜面、平板等形式。2.按制备后培养基外观的物理状态来分③半固体培养基(semi-solidmedium)：在液体培养基中加入0.2～0.7%的琼脂构成的培养基。常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。④脱水培养基（dehydratedculturemedia）：脱水商品培养基，预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分精确又有使用方便等优点的现代化培养基。1.不被微生物分解、利用、液化；2.不因消毒灭菌而被破坏；3.在微生物的生长温度内保持固态；4.凝固点的温度对微生物无害；5.透明度好，粘着力强。理想凝固剂应具备的条件比较内容琼脂明胶常用浓度熔点℃凝固点℃pH灰分（%）氧化钙（%）氧化镁（%）氮微生物可利用能力1.5~2%9640微酸161.150.770.4绝大多数微生物不能利用5~12%2520酸性14-150018.3不少微生物能利用琼脂(agar):石花菜中提取的高度分支的复杂多糖明胶(gelatin):胶原蛋白制备产物硅胶(silicagel):硅酸纳与盐酸聚合而成，纯无机物凝固剂种类:①基础培养基(minimummedium):是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基；另外基础培养基也可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基时）。②选择性培养基(selectivemedium)：是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要，或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。3.按特殊用途划分③鉴别性培养基(differentialmedium)：用于鉴别不同类型微生物的培养基，在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物，例：伊红美兰乳糖培养基（EosinMethyleneBlue）。④加富培养基(enrichedmedium)：在普通培养基中加入某些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）和分离某中微生物。G+菌受抑制G-菌能发酵乳糖产酸不发酵乳糖不产酸，菌落无色透明产酸力强，菌落呈紫绿色金属光泽产酸力弱，菌落棕色EnterbacterKlebsiellaHafniaSarrdiaProteusSalmonellaShigellaE.coli试样EMB在鉴别各种肠道杆菌中的作用：Left:Escherichiacolicells.Right:E.colicoloniesonEMBAgar.EMB(EosinMethyleneBlue)细菌培养基——营养肉汤（nutrientbroth)：牛肉膏3g；水1000ml；蛋白胨5g；pH7.2~7.4放线菌培养基——高氏1号：可溶性淀粉20g；KNO31g;K2HPO41gMgSO40.5gNaCl1g;FeSO4•7H2O0.5g水1000ml;pH7.2~7.4霉菌培养基——查氏（zapek)培养基：蔗糖30g;KCl0.5g;MgSO4.H2O0.5g;FeSO40.5g水1000ml;K2HPO41g;NaNO33g;pH6.7酵母菌培养基——麦芽汁培养基①细菌培养基②放线菌培养基③霉菌培养基4.根据所培养的微生物类群来分①种子培养基(seedculturemedium)：是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养基的基质。②发酵培养基(fermentationmedium)：用于生产预定发酵产物，一般碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。5.根据培养目的来分味精生产菌北京棒状杆菌AS1299：一级种子（用摇床培养）培养基配方：葡萄糖3%玉米浆2.5~3.5%尿素0.3~0.5%K2HPO40.1~0.2%MgSO40.05%二级种子（1200升发酵罐）培养基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分相同。Thepowderisweighedanddissolvedinaspecifiedamountofwater.pHischeckedandadjusted.Thenthemediumissterilizedat121ºCat15lbs/sq.in.pressurefor15minutes.Heatlabilecompoundsthataretobeaddedtothemediumshou