组学研究及案例分享-5环境微生物

Realtime-PCR、电泳、酶切、抗体免疫、Sanger测序、焦磷酸测序质谱、芯片环境微生物的研究方法单菌/种群测序技术宏基因组测序技术项目设计案例单株菌的基因组测序三代单分子测序PacbioRSII读长8~15kb应用：单株基因组完成图、精细图同一类型菌株的群体进化研究不同类型菌种的基因组比较研究二代高通量测序Hiseq2500、4000读长250~300bp转录组实验流程EukaryoteProkaryoteTotalRNAEnrichmRNAbyOligo（dT）RemoverRNARandomhexamerprimedcDNAsynthesisSizeselectionandPCRamplificationIlluminasequencingRNAfragment(200nt)原核转录组只能通过降解rRNA来富集mRNA和LncRNA宏基因组学（Metagenomics）以特定环境下的整个微生物群落为研究对象，利用新一代高通量测序技术可以最大限度的挖掘微生物基因组信息，群落结构和功能与代谢网络。5单菌基于培养的菌株群落多样性差异99%不可分离培养！无偏性未加培养的原状态菌群简单的环境：空气菌群、混合菌种、活性污泥菌群、肠道菌群复杂的环境：土壤、海洋两种技术路线——单菌和群落HMPSolexareads(124EUindividuals)454reads(18USindividuals)Sangerreads(13Japaneseindividuals)MetaHIT参考物种集178个细菌基因组数据参考基因集330万个基因数据流感嗜血杆菌人体细胞总数中只有10%是人细胞。1.5kg细菌生活在人肠道中。人肠道中有1000种以上的细菌。至少存在3百万以上的基因。V1V2V3V4V5V6V7V8V9454，400bp，V3V5454，400bp，V1V3Hiseq2000,100PE454，400bp，V4V6Hiseq2000,150PE7通过指定环境中微生物16SrDNA高变区PCR扩增产物的高通量测序；分析微生物群落的多样性，包括物种的分类信息和丰度信息等。研究对象：特定环境中细菌或古菌。1bp1542bpV6区Read1100basesRead2100basesV3区Read1150basesRead2150bases宏基因组16S测序100Mdata6万条reads测序平台：MiseqPE30016S18SITR8环境样本(TotalRNA)dscDNA(mRNA)DNA≥5G1G宏基因组宏转录组组装、物种功能注释Mapping宏基因组：参考数据集宏转录组：1GSurvey，评估样品的rRNA去除率、复杂度等宏转录组：5-10Gdeepsequencing，深度挖掘环境基因表达模式深度测序Survey≥5G物种分类、基因表达模式宏基因组+宏转录组多样性鉴定多态区测序深度测序9信息分析流程根据样本制备情况二选一测序类型文库类型91PE/101PE小片段文库180bp宏基因组的各种测序策略10环境微生物群落全基因组扩增（WGA）DNA提取全基因组测序与分析RNA提取单细胞分离保守基因扩增SSU（16rRNA）、ITSFosmid/Cosmid/BAC文库构建总DNA的高通量测序（NGST）PCR产物直接测序NGST序列分析（比对、注释、多样性分析、系统进化分析等）筛选目标阳性克隆（PCR、特殊性状）批量Fosmid文库DNA提取、混合步移法测序混合文库DNA高通量测序克隆、测序Sanger序列组装与分析（物种注释与功能注释）RNA逆转录，合成cDNA总cDNA的高通量测序（NGS）去除rRNA保留rRNA宏基因组分析群落结构与功能宏转录组分析基因表达活性MetagenomicsMetatranscriptomicsEelriverSedimentUS,JGI2004-042006-062009-012010-032010-052011-012011-07SargassoseaUS,JCVISoilMetagenomesUS,JGICowrumenUS,JGIHMP,US,NIHHumanGut,EU&BGIHumanGut,US,NYU2007-07HumanGut,JapanHumanGut,US,WUMouseGut,US,WUHumanGut,EUTermitegutUS,JGI采用高通量测序进行宏基因组研究项目样品数目数据产量（Gb）MetaHIT肥胖研究177858MetaHITIBD疾病研究143665中国人糖尿病研究73171人组织的病毒研究119511大肠癌研究732总数5192,23713通过16SV3、V4区的高通量测序对不同品系，不同发育阶段的马铃薯根际土壤与非根际土壤的微生物群落多样性。1.取6个马铃薯品系，3个发育阶段（生长期、成熟期、衰亡期）的根际与非根际土壤，共20份样品；2.提取土壤DNA，进行16SrDNA的V3V4区扩增测序；3.比较不同品系生长时期，不同品系对根际与非根际土壤微生物多样性差异。1.马铃薯种植区土壤以放线菌纲、α-变形菌纲及一未知微生物类群为主要优势菌；2.主成分分析（PCA）结果表明不同生长时期的根际与根外土壤环境有明显差异；3.根际微生物在马铃薯生长期较成熟期和衰亡期的品系效应明显；4.根据根际微生物可将6个不同品系样品聚为2组，与基于马铃薯块茎淀粉含量的分组结果一致。马铃薯根际与非根际土壤的微生物多样性比较16SrDNA高变区测序材料背景结果讨论研究思路141516对红树林微生态系统进行溢油模拟实验；通过16S测序直接监测污染前后红树林沉积物的微生物群落动态变化。1.取红树林沉积物模拟油污实验，油污比例2%，5%（v/w）；时间点为0d，23d，66d；重复实验一组，共10个样品。2.提取沉积物DNA，进行16SrDNA的V4区扩增测序；3.比较模拟环境下：不同石油污染浓度，不同污染时间下红树林沉积物的微生物群落多态性1.污染前后红树林微生物群落多样性有明显差异，γ-变形菌纲和∆-变形菌纲分别为污染前后优势菌；2.在2%和5%油污下，色菌目和海仙菌属微生物丰度明显下降，可作为石油污染的敏感指示菌；3.海杆菌、海细菌、解环菌三属微生物在污染条件下丰度增加，可作为红树林环境石油生物监测的靶标微生物。4.后期可通过qPCR定量特定菌属的微生物水平来监控红树林的石油污染状况及评估污染对生境的干扰。红树林石油污染模拟系统的微生物群落监测16SrDNA高变区测序材料背景研究思路结果讨论17门（A）、纲（B）、目（C）、D（属）色菌目（C图红色），和海仙菌属（D图蓝色）微生物丰度明显下降可作为石油污染的敏感指示菌18首次通过“多组学”（16S+宏基因组+宏转录组）研究方法：揭示同一温带沿海环境在季节和昼夜更替下微生物群落的结构与功能多态性。1.对同一温带沿海环境分三个季节(冬季、春季、夏季)，两个时间段（白天、晚上）共8个时间点取表层水样。2.分别提取DNA和RNA,DNA用于宏基因组测序，和16SV6扩增后测序；RNA进行宏转录组测序。3.结合三部分数据比较不同季节与昼夜条件下微生物群落物种和功能差异。1.细菌和古菌随季节变化大致趋势一致，但是古菌的多样性较细菌小；2.16S与转录组测序在反映物种多样性方面结果一致；3.冬天和晚上微生物菌群的多样性相对高；4.16S和宏基因组测序结果可以较好的反映季节变化，宏转录组测序结果可更好反映昼夜变更；5.一些关键基因随季节和昼夜发生明显变化，还有大量的未知基因也随季节和昼夜变化明显，有待进一步的研究。海洋微生物群落季节与昼夜交替的变化研究背景研究思路结果讨论1916S+宏基因组+宏转录组数据的覆盖度统计基于16S数据的8个样本物种多样性与丰度统计201.实验室型中肠道以革兰氏阳性菌为主，其中沃氏葡萄球菌为绝对主要优势菌（＞80%）；并通过组装获得了两株未培养菌近全序列的基因组；2.野生型中肠道以革兰氏阴性菌为主，有大量纤维素酶基因；3.实验型与野生型中肠微生物在种群结构与多样性上有较大差异；但功能聚类模式相似；4.饮食与中肠微生物组成显著相关，表明食物对肠道微生物组成具有选择压力。通过宏基因组学方法比较野生与实验室条件下，欧洲玉米螟中肠微生物群落的结构与功能。1.采集野生与实验室条件下欧洲螟虫，无菌条件下解剖中肠至特定培养基；2.将中肠样本进行微生物富集培养1-3天；3.提取DNA，进行高通量测序；4.两组肠道微生物样品的比较分析。野生型与实验型玉米螟的肠道微生物比较宏基因组调查材料背景研究思路结果讨论21测序数据统计分析实验室（A）与野生型（B）欧洲玉米螟的中肠道微生物多样性科水平分类比较沃氏葡萄球菌22实验型与野生型的共有和特有基因比较分析整体代谢通路比较分析实验型野生型23宏转录组加拿大麝牛瘤胃真核微生物群落的宏转录组——植物细胞壁降解酶基因的活性表达研究1.高纤维食物饲喂，瘤胃插管取样；2.真核微生物的mRNA提取；3.Illumina测序，2.8Gb；4.组装与数据分析（纤维素酶相关基因表达信息挖掘，CAZy数据库）1.真核微生物宏转录组测序，发现麝牛瘤胃中存在大量纤维素酶相关基因；平均每Gb宏转录数据分析得到的碳水化合酶活性基因是以往牛瘤胃宏基因组研究的8.7倍。2.通过测序为木质纤维素酶的工业应用提供候选基因资源。麝牛瘤胃真核微生物的宏转录组研究材料背景研究思路结果讨论24组装结果基于NRMO注释结果的物种分类统计以牛瘤胃厌氧真菌和纤毛原生动物为主25北京中科院动物研究所16SrDNA全长测序及宏基因组测序1.PCR产物TA克隆16SrDNA测序，得到5522个近乎全长序列，85个OTUs；2.宏基因组测序，3个野生大熊猫，350bp，SE90测序，83M高质量reads，组装得到接近37Mbpcontigs；3.Metagene预测ORF，MEGAN分析，KEGG分析，COG分析，HMMs分析（基因家族）熊猫肠道宏基因组研究解读其纤维素代谢功能材料背景研究思路结果讨论7个野生大熊猫和8个饲养大熊猫的粪便样本1.13个OTUs与梭菌属1组和XIV组关系相近，7个是大熊猫所特有的；2.梭菌属1组中发现分别编码2个纤维素消化酶、1个半纤维素消化酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和β木糖苷酶基因3.寡糖降解相关酶类丰度为36%（人37%），且含有丰度很低的纤维素酶和半纤维素酶（2%）。28中科院上海生科院云南西双版纳培菌白蚁（工蚁，兵蚁）的肠道微生物——木质纤维素降解基因的资源挖掘1.肠道微生物DNA提取；2.微量DNA样品的全基因组扩增（MDA）；3.Fosmids文库构建；4.基因功能的克隆筛选；（内切葡聚糖酶；β-糖苷酶；木聚糖酶；纤维二糖水解酶）5.13个混合阳性克隆的454高通量测序6.酶的体外表达与验证MDA＋混合Fosmids文库高通量测序+体外表达1.构建宏基因组文库（10,000克隆），保存可培养白蚁肠道微生物基因资源库；2.筛选得到12个β-糖苷酶活性克隆；1个木聚糖酶活性克隆；测序并得到全长序列。3.对Xyl6E7体外表达发现其PH值耐受范围广（pH4.5-10），稳定性好，可成为潜在生物能源酶。白蚁肠道宏基因组——木质纤维素基因挖掘材料背景研究思路结果讨论29中山大学+上海交通大学深海热液口黑烟囱环境的微生物群落与功能分析；以及多环境样品（数据库数据）比较分析。1.取深海热液口黑烟囱样品提取DNA；2.构建Fosmids文库，共2880个克隆；3.提取混合文库总DNA，进行高通量测序分析及多环境样品功能比较分析；4.设计特异基因引物对文库进行筛选目标克隆；5.目标质粒的步移法测序，特异基因及基因簇分析。1.基于双向聚类的比较宏基因组学分析表明两个深海热液口样品中带有大量的错配修复和同源重组基因；2.大量的转移酶表明基因水平转移在热液口烟囱环境微生物非常普遍；3.高丰度的趋药性和鞭毛装配功能微生物对动态烟囱壁环境的一种适应机制；4.PCR筛选得到相关代谢功能基因簇推测化