药物分析方法分析化学部分

第二章药物分析方法——分析化学部分长春中医药大学学生:06级药事管理一、柱色谱的实验操作5.3经典液相色谱法(二)、加样(三)、洗脱与馏分的收集(一)、装柱内径:柱长=1:10~20湿装法和干装法体积小等份收集(四)、化合物的检出二、薄层色谱法(thinlayerchromatography；TLC)固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，（密闭的容器中）展开，斑点显色，（与对照物质）比较进行定性定量。（一）定性参数比移值(Rf值)溶质移动距离与流动相移动距离之比。（速度之比？）Rf=L/L0（定时展开）L为原点（origin）至斑点中心的距离，L0为原点至溶剂前沿（solventfront）的距离与组分及色谱条件有关相对比移值(relativeRf；Rr)Rr=Rf(i)/Rf(s)=L(i)/L(s)与组分、色谱条件、参考物质有关。Rr值可以大于1，也可以小于1。重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差（参考物质与组分在完全相同的条件下展开）（二）吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂吸附剂1.硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活化：加热至100℃左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。2.氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)——酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。展开剂(流动相)极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳环己烷石油醚。展开剂选择原则：根据被分离物质的极性Stahl简图：极性物质—活度低（活性级大）的吸附剂--极性展开剂混合溶剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。（三）薄层色谱操作方法制板均匀点样集中展开(多种方式)预饱和显色（四）定性和定量分析定性分析比较Rf值或Rr值、斑点颜色或荧光常采用已知标准物质对照（同一板上展开）多种展开系统的Rf值与对照品一致。定量分析洗脱法直接定量法1.目视比较法（如杂质限度检查方法）2.薄层扫描法5.4高效液相色谱法highperformanceliquidchromatograpphy,HPLC高效液相色谱法是采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有填充剂（固定相）的色谱柱进行分离测定的色谱方法。经由进样阀注入的供试品，有流动相带入柱内，各成分在柱内被分离后，依次进入检测器，有记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。一、高效液相色谱法的特点featureofHPLC特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC1.流程2.主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(2)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(3)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(4)液相色谱检测器a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。三、化学键合色谱法（BPC）1.反相键合色谱法（RBPC）固定相：十八烷基（ODS或C18）键合相流动相：甲醇-水；乙腈-水分离原理：疏溶剂理论、双保留机制、顶替吸附—液相相互作用模型等。化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N流动相极性与容量因子的关系：底剂：水极性增大，洗脱能力降低，k?应用：用于分离非极性至中等极性的各种分子型化合物。2.正相键合色谱法固定相：氰基与氨基键合相流动相：正己烷+极性溶剂分离原理：固定相与溶质分子间的取向力、诱导力、氢键力。流动相极性与容量因子的关系：极性增大，洗脱能力增加，k?氨基键合相色谱柱主要要用于糖类的分离。3.离子抑制色谱法1.适用范围：3.0≤PH≤7.0的弱酸及7.0≤PH≤8.0的弱碱。2.抑制剂：向流动相中加少量弱酸、弱碱或缓冲盐为抑制剂，调节pH，抑制样品的解离。3.容量因子及影响因素：弱酸：PH小于pka时，组分以分子形式存在为主，k大。弱碱：情况相反。4.离子对色谱ionpairchromatography原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；四、色谱法的应用采用峰面积法或峰高法(1)内标法(2)外标法1定性分析2定量分析外标法——标准曲线法用待测组分的纯样制标准曲线优点：快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可缺点：绝对法,进样量,操作条件要不变长春中医药大学外标法——外标一点法当外标试样中各组分浓度变化范围不大时，可不必绘制标准曲线，而用单点校正法，即配制一个和被测组分含量十分接近的标准溶液，定量进样，由被测组分和外标组分的峰面积或峰高比来定量WiWs=AiAs长春中医药大学内标法将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量以及相应的峰面积比，求出含量mi=fi×Aims=fs×Asmims=fi×Aifs×As长春中医药大学内标校正曲线法和内标对比法配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物，进样分析，测得Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图。（Ai/As）样=Ci样（Ai/As）标Ci标气相色谱法与高效液相色谱法的定性参数是（），定量参数是（）薄层色谱法的定性参数是（）。气相色谱仪和高效液相色谱仪的组成简述气相色谱法和高效液相色谱法的主要异同点薄层色谱法中，比移值的最佳范围是（）化合物A在薄层板上从原点迁移7.6cm，溶剂前沿距原点16.2cm，计算化合物A的Rf值。若在相同溶剂系统中，溶剂前沿距原点14.3cm，化合物A的斑点应在薄层板上何处？精密称取黄芩颗粒0.1255g置50ml容量瓶中，外标法测定黄芩颗粒中黄芩素的含量，测得对照品溶液（5.98ug/ml）和供试品溶液的峰面积分别为：706436和458932，求黄芩颗粒中黄芩素的含量。