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山东大学实验报告2016年5月23日1【实验目的】1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。4.学习细胞生死状态鉴别的方法。5.了解细胞生死状态鉴别的原理。6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。2.细胞生死状态的鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。【实验材料】山东大学实验报告2016年5月23日21.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红【实验步骤】1.取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌5分钟。取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿，待用。2.分离脾细胞用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。3.培养脾细胞超净工作台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400μl加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200μl脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。4.台盼蓝法鉴定细胞的生死状态：（1）试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3）染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。（4）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。或者（3）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10´物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。（4）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数*100%附：血球计数板血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分割成两半，每个半边上面各有有一个方格网，每个方格网共分九大格，其中间的一大格（又称计数室）常被用作细胞的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，他们都有一个共同特点，即每个大方格都有400个小方格组成。每个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1mm2,每个小方格的面积为1/400mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体山东大学实验报告2016年5月23日3积为0.1mm3，所以每个小方格的体积为1/400mm3若取四个大方格的细胞数，则：每毫升液体中细胞的数=每个大方格中的细胞数量*10000*稀释倍数【实验结果】死细胞活细胞项目左上左下右上右下中总细胞148161715死细胞75895细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞总数）/细胞总数X100%=（14+8+16+17+15-（7+5+8+9+5））/（14+8+16+17+15）*100%=51.43%每毫升液体中细胞的数=(70/5)*25*(16/25)*10000=3500000【实验结果分析】1.活细胞边缘较明显，而求细胞膜维持正常的选择透过性，染料无法通过，所以呈现透明无色2.死细胞由于细胞膜不再具有生物活性，染料从细胞膜通过，将细胞染色，且死细胞的边缘不明显。3.将培养基刚从培养箱拿出来时，培养基的颜色应呈现无色（由于细胞的代谢产物为酸性以及培养箱中的二氧化碳浓度较高），过一段时间后渐渐恢复粉红色。4.用倒置显微镜观察时，可以看到在黄色的背景下有一些透明的细胞。【注意事项】1.在进行方格查数时注意：数上不数下，数下不数上。2.实验涉及的台盼蓝染料有致癌危险，因此滴加染液时要小心，防止溅到皮肤上。3.动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净山东大学实验报告2016年5月23日4工作台中使用，整个实验过程都要有无菌操作的概念，避免细胞被污染。4.在超净工作台内点燃酒精灯后，实验操作应在火焰的附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后要待其冷却才能夹取组织，经过培养液的用具不能长时间烧灼，以免烧焦形成碳膜。5.超净工作台内吸取溶液用的的各种吸管等不能混用，以免相互污染。6.在超净工作台中，组织细胞、培养液等不能敞开暴露过久，以免溶液蒸发和pH变化。7.器皿、离心管培养瓶等在离开超净工作台前必须将盖子或橡皮塞盖紧，以防止细胞污染或溶液漏出。【反思与总结】1.做实验的时候由于显微镜的光线问题，死细胞的颜色有时不太明显，在观察的时候需要注意。2.将脾加入到培养基后，准备将其加入到培养箱培养时，检测一下培养基中是否有气泡，若有气泡的话，则应除去后再放置。3.用注射器的针头对小白鼠的脾进行穿孔时要小心操作，既不能刺得太狠将脾弄破，也不能刺得太轻使得到的脾细胞过少。4.注意进行无菌实验操作的规范，身体只有消过毒的部分才可进入超净工作台，防止身体的其他部分将细菌带入。5.注意用倒置显微镜观察培养基中细胞的正确方法。