大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌检查法EscherichiaColiTestMethod1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。3.责任者QC化验员。4.程序：4.1.简述4.1.1.大肠埃希菌(Escherichiacoli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。4.1.2.用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。4.1.3.原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。4.2.仪器、设备及用具4.2.1.无菌室4.2.2.净化工作台4.2.3.培养箱(36±1℃)4.2.4.高压蒸汽灭菌器4.2.5.显微镜(1500X)4.2.6.微波炉4.2.7.恒温水浴（45±1℃）4.2.8.离心机(500～4000r/min)4.2.9.0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器4.2.10.电冰箱4.2.11.匀浆仪4.2.12.366nm紫外灯4.2.13.玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1.0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。4.3.2.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。4.3.3.甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。4.3.4.V-P试液α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。4.3.5.革兰染色液4.3.5.1.结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。4.3.5.2.革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。4.3.5.3.脱色液95％乙醇4.3.5.4.沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。4.3.6.亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。4.3.7.溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0～7.6(黄→红)4.3.8.酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。4.3.9.曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。4.3.10.无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯801ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。4.3.11.无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2)取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。4.3.12.无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。4.3.13.中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围Ph6.8～8.0（红→黄）。4.3.14.无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。4.4.培养基4.4.1.营养肉汤培养基胨10g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。4.4.2.营养琼脂培养基胨10g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml琼脂14.0g取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。4.4.3.胆盐乳糖培养基（BL）胨20.0g磷酸二氢钾1.3g乳糖5.0g牛胆盐2.0g氯化钠5.0g（或去氧胆酸钠）(0.5g)磷酸氢二钾4.0g水1000ml除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。4.4.4.4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β-D-glu-curonide,MUG）培养基胨10.0g磷酸二氢钾（无水）0.9g硫酸锰0.5mg磷酸氢二钠（无水）6.2g硫酸锌0.5mg亚硫酸钠40mg硫酸镁0.1g去氧胆酸钠1.0g氯化钠5.0gMUG75mg氯化钙50mg水1000ml除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。4.4.5.曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）营养琼脂培养基100ml曙红钠指示液2ml20%乳糖溶液5ml亚甲蓝指示液1.3-1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。4.4.6.麦康凯琼脂培养基（MacC）胨20.0g1%中性红指示液3ml乳糖10.0g琼脂14.0g牛胆盐5.0g水1000ml氯化钠5.0g除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。4.4.7.蛋白胨水培养基胰蛋白胨10g氯化钠5g水1000ml取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。4.4.8.磷酸盐葡萄糖胨水培养基胨7g磷酸氢二钾（K2HPO4）2g葡萄糖5g水1000ml取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。4.4.9.枸橼酸盐培养基氯化钠5g枸橼酸钠（无水）2g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g溴麝香草酚蓝指示液20ml磷酸氢二钾（K2HPO4）1g琼脂14g硫酸二氢铵（NH4H2PO4）1g水1000ml除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。分装于小试管，灭菌，制成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。4.4.10.乳糖培养基胨20.0g乳糖10.0g0.04%溴甲酚紫指示液25ml水1000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。5%乳糖培养基胨0.2g溴麝香草酚蓝指示液6ml氯化钠0.2g乳糖5g磷酸氢二钠0.2g水100ml除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min。4.5.对照用菌液取大肠埃希菌[CMCC(B)44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36±1℃培养18～24小时，取均匀培养物1ml用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。4.6.准备4.6.1.检验量4.6.1.1.每批供试品检验量，一般为10g或10ml，特殊贵重或微量包装的供试品检验量可以酌减。4.6.1.2.供试品均须取自2个以上的包装单位。4.6.2.供试液的制备4.6.2.1.液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)至100ml，混匀，作为供试液。4.6.2.2.固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。4.6.2.3.非水溶性供试品方法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂的量，制成1：20～1：100供试液。4.6.2.4.含抑菌成分供试品供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时，表明供试品有抑菌活性。该供试液按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。稀释法取规定量的供试液接种到较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。离心沉法取一定量的供试液，500转/分离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。薄膜过滤法取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为47mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。中和法取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液(含1％对氨基苯甲酸约1～5ml)中，含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中(表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用)。沉降法取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。4.7.检查方法验证在建立供试品的大肠埃