BCA蛋白检测方法

BCA蛋白检测方法Bicinchoninicacid(BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。BCA定量中的A和B液BCA定量中的A和B液的成分是什么，作用是什么？试剂A：BCA(bicinchoninincacid)碱性溶液试剂B：硫酸铜溶液作用：BCA与二价铜离子的硫酸铜溶液等其他试剂组成的试剂，混合后显示苹果绿色。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合两个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物。试剂(1)试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2L，混合。（4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。(5)待测样品。1、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。待测样品浓度在50～2000微克／毫升浓度范围内有较好的线性关系BCA蛋白检测BCAProteinAssay是基于在碱性条件下，Cu2+被蛋白还原成Cu+，进而发生高敏感性和选择性的颜色变化，通过分光测定，精确定量蛋白质浓度。此方法与Bradford蛋白检测一道，并列成为当今世界上最为常用的两种蛋白浓度检测方法。特点：1．高兼容性，尤其适用于表面活性剂存在下的蛋白浓度检测，如细胞或组织的蛋白提取物。2．高敏感度。可精确定量1～2000μg/ml蛋白样品。3.受温度和时间影响较大，需准确定时、定温，以保证蛋白的精确定量。4.检测蛋白提取物或纯化蛋白样品，应使用相应的缓冲液制备蛋白标准曲线。同时样品的检测条件要与蛋白标准曲线的检测条件保持一致，如37℃放置30分钟。5.562nm测定，也可用接近的波长检测，如570nm。6.此检测试剂不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%的TritonX-100，5%的Tween20，60，80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于1mM，β-巯基乙醇低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于1mM。