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SHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY论文题目：淋巴靶向磁共振造影剂的制备及失效分析学生姓名：刘恬学生学号：1130509106专业：材料科学与工程学院任课教师：朱君签名：引言：肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的重要原因。据目前统计显示，我国新诊断的肿瘤患者中一年复发率为60%，死于肿瘤复发和转移的患者超过80%。“早发现、早诊断、早治疗”成为防止肿瘤发展、减少术后复发和转移的重要途径。因此，研究肿瘤早期诊断和治疗的方法具有重要的研究意义和社会价值。一般而言，肿瘤转移的途径主要包括血路转移、种植转移和淋巴转移，其中淋巴转移被认为是肿瘤转移的最主要因素。对于血路转移和种植转移，目前临床上分别可以通过检查外周血液中的肿瘤细胞数量和腔体内游离肿瘤细胞数量评估肿瘤是否发生转移，从而实现肿瘤转移的早期无创伤诊断。但是对于淋巴转移，虽然目前临床上可以通过影像技术对淋巴结的检查来实现淋巴转移的无创诊断，但这种依赖于淋巴结形态、大小、有无融合及坏死等结果判断其良恶性的手段存在敏感性及特异性不足的缺点，易造成假性结果，有时正常大小的淋巴结可能已经发生肿瘤转移及浸润。因此，研究淋巴结诊断技术对预警肿瘤淋巴转移至关重要。一．淋巴肿瘤转移肿瘤淋巴转移是指浸润的肿瘤细胞穿过淋巴管壁，脱落后随淋巴液被带到汇流区淋巴结，并且以此为中心生长出同样肿瘤的现象。近期研究发现，在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞所分泌的各类血管内皮生长因子（VEGF）与淋巴管内皮细胞上的相应受体结合，能诱导肿瘤组织内或周围新生淋巴管形成，还能诱导前哨淋巴结（SLN）内新生淋巴管形成，从而促进肿瘤向淋巴系统的转移。如图1所示，当肿瘤细胞到达前哨淋巴结之后，淋巴结中淋巴管新生现象更加严重，并随着VEGF到达下一节淋巴结后，又诱导远端淋巴结新生淋巴管并继发肿瘤的下级淋巴结转移[1]。图1肿瘤细胞在前哨淋巴结中的转移过程由此可见，对淋巴结的诊断是判断肿瘤淋巴转移的关键。近年来，影像学技术在评估肿瘤淋巴转移中发挥了越来越重要的作用。这种技术主要是通过对被肿瘤细胞侵入的淋巴结进行诊断，是一种非侵袭性的、可对全身淋巴结进行评估的方法。二．基于靶向造影剂的影像诊断技术发现淋巴结受肿瘤细胞侵犯后，其功能和内部结构等特异性信息的变化，从而可以根据淋巴结的形态学及功能学的改变，对淋巴结做出更加准确、及时的诊断。靶向造影剂是通过将目的分子特异性抗体或配体连接到成像试剂上，构筑的特异性造影剂，使得成像技术从传统的大体形态学成像向微观形态学、生物代谢、基因成像等方面发展。因此，构建淋巴结靶向造影剂成为淋巴结影像技术发展的方向。1．淋巴结靶向超声造影剂近年来，随着超声造影技术的发展，研制能够到达靶区成像的超声靶向造影剂已经成为国内外研究的热点。有研究表明，超声微泡造影剂更容易发现淋巴结，并可以对淋巴结进行示踪[2-3]。例如，Niu等人[4]制备了一种以聚乳酸-羟基乙酸为载体，以全氟化碳气体为造影剂，同时掺杂了四氧化三铁的聚合物微泡造影剂，并在体内实验中验证了其对淋巴结有靶向作用。如图2所示，以生理盐水为参照，验证了聚合物微泡造影剂超声成像的淋巴靶向性。图A1、A2、A3、A4分别为注射生理盐水之前、10s、2min、5min之后的超声成像图；图B1、B2、B3、B4分别为注射靶向为造影剂之前、10s、2min、5min之后的超声成像图。由图可见，微泡造影剂对淋巴结有很强的靶向成像效果。图2兔子肿瘤淋巴结在注射不同造影剂的超声成像图另外，wisner等人[5]研究了微泡超声造影剂在淋巴系统成像中的应用。如图3所示，在狗的腿弯部位皮下注射壳包裹聚合物的造影剂36min之后的超声成像效果。由图可见，此种造影剂对淋巴结和淋巴管有85%的增强效果。研究结果表明，亚微米的造影剂由于其尺寸较小，通过淋巴系统更容易，因此有较好的淋巴显像效果。图3小狗腿弯部位的三维渲染能量多普勒超声成像图2．淋巴结靶向磁共振造影剂目前研究的淋巴结靶向磁共振造影剂主要包括大分子/钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）[6-8]、蛋白质/Gd-DTPA复合物[9]、超顺磁性氧化铁颗粒（USPIO）[10-13]等，这些造影剂通过被动靶向作用，即通过淋巴结中的吞噬细胞吞噬作用，有效地集聚在淋巴结中，提高淋巴结的信噪比和信号强度，可以较好地区分良恶性淋巴结。例如，在正常新西兰白兔膝后窝部位静脉注射右旋糖酐-DTPA-Gd后，造影效果被明显增强[14]。如图4所示，图A1、A2、A3、A4分别是新西兰白兔下肢的膝后窝淋巴结在注射造影剂右旋糖酐-DTPA-Gd（M1,0.004mmolGd/kg）之前、注射之后30min、2h、3h的磁共振成像图。由图可见，随着时间的增加，造影剂对淋巴结的成像效果越来越明显。图4新西兰白兔下肢的正常膝后窝的淋巴结核磁共振成像图USPIO能被正常或反应增生的淋巴结中的吞噬细胞吞噬，并暂时在淋巴结蓄积，使得淋巴结的磁敏感度明显增加，导致淋巴结的MR成像信号强度下降。而转移性的淋巴结，肿瘤细胞在淋巴结内增值并压缩、阻塞以及破坏淋巴窦，阻碍巨噬细胞对USPIO的吞噬，导致淋巴结对USPIO不摄取或摄取减少，借此可以区分良恶性淋巴结。图5为静脉注射USPIO造影剂后，病人的淋巴结成像图。图5A为T2加权成像，图5B为T1加权成像。如图所示，大的淋巴结为恶性肿瘤，而箭头所指的小淋巴结为良性肿瘤[15]。图536岁病人的原发肿瘤阶段开发出具有主动靶向性能的造影剂，实现淋巴管对造影剂的主动转运和淋巴结对造影剂的特异性结合，从而提高成像效果、缩短成像时间是当前淋巴结靶向造影剂研究的方向。这种靶向造影剂可以达到准确、高效地通过对肿瘤细胞侵犯淋巴结时其结构变化的研究，实现对肿瘤淋巴转移的早诊断、早治疗。随着影像学与诊断学的进步，相信肿瘤的诊断有极大的研究价值和应用潜力，会为肿瘤的治疗带来新希望，也必将有其广阔的发展前景。三．实验设计本文的设计考虑了诸多因素，从不同学科的角度分析了目标产物的有效性及实验过程的可行性，现归纳总结如下：1．生理学依据淋巴系统遍布于全身，由淋巴液、淋巴管、毛细淋巴管及淋巴结等部位组成。淋巴系统具有其独有的特点：它在机体免疫抗感染方面起到重要作用；另外，药物若经淋巴液吸收可避免肝脏首过效应。试图利用淋巴系统转运药物，研究淋巴系统的靶向已引起人们的极大关注。在正常的生理状况下，淋巴系统会选择地吸收组织液中的大分子物质和少量的水。因为淋巴管中单向瓣膜的存在，淋巴系统选择吸收的功能就由毛细淋巴管的作用来完成。毛细淋巴管的结构如图6所示。毛细淋巴管是埋藏在组织中的细微盲管，直径一般为10～15µm。管壁由多个单层内皮细胞组成，内皮细胞的平均厚度为0.3µm。细胞较大，外形不规则。内皮细胞间存在30～120nm的开放间隙，而毛细血管的孔径小于4nm。由此可见，粒径大于4nm的物质经皮下或者皮内注射后，不能透过孔径较小的血管内皮，但可以通过毛细淋巴管内皮细胞间隙，或者由内皮细胞的胞饮作用进入淋巴系统[16-18]。图6淋巴组织示意图2．病理学依据：在临床实践中，淋巴结转移是恶性肿瘤复发和致死的主要原因。尽早地观察到淋巴结是否转移，对于肿瘤的分期、治疗方案的选择等均有较大的影响。正常淋巴系统中可通过内皮细胞间隙吸收造影剂，并在淋巴结中由巨噬细胞吞噬并分解；而转移的淋巴结中的巨噬细胞被肿瘤细胞代替，不能吞噬造影剂，因此造影时肿瘤转移和未转移淋巴结产生影像信号的对比。通过淋巴系统的显影信息，提供淋巴结和淋巴管准确的位置和数目，便于判断局部淋巴结是否有微小的转移灶，作出准确的临床分期，确定相应的治疗方案，减少不必要的手术。因此，靶向淋巴造影技术可以作为淋巴结转移的早期鉴定手段,对肿瘤的及时治疗起到了关键作用[19-21]。3．磁共振物理学依据某些过渡金属元素如钆（Gd）、铁（Fe）、锰（Mn）和镝（Dy）等均具有顺磁性，其原子结构特点为外层电子不成对，在外磁场存在下具有较大的磁矩和正磁化率。顺磁性造影剂即含有具有以上特性的金属离子（Fe2+、Fe3+、Mn2+、Gd3+或者Dy3+）。其中位于元素周期表25位的稀土元素——锰（Mn），有7个未成对电子，自旋磁矩大，弛豫效率高，易与多个水分子配位，其水溶性较好，是顺磁性造影剂的较佳选择[22]。Mn由于具有可变的氧化价态、出色的阳离子交换能力、分子吸附以及在电化学、磁性能方面的优异性能，因而，在氧化-还原、分子筛、锂离子电极及磁性材料等领域有着广阔的应用前景。4．化学依据介孔材料较原有的微孔沸石分子筛和大孔材料，不仅孔径适中(2～50nm)，而且具有较大的比表面积和壁厚，同时具有较高的热稳定性和水热稳定性。这类材料不仅突破了传统分子筛微径范围过小(1.5nm)，而且孔道大小均匀、六方有序排列，径在2～10nm范围内规则连续可调。因此有序介孔材料一经出现即引起材料科学界的高度重视[23]。由于纯氧化硅有序介孔材料骨架中晶格缺陷少、催化活性低，因此将一些金属原子引入介孔氧化硅骨架以增加其分子筛催化性能，成为近年来研究的热点，如掺杂Al，Ti，Cr等均表现出优异的催化特性。肿瘤血管生成不仅受到生长因子（如VEGF、FGF和TNF-α等）的调控，而且与肿瘤的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）成分（如FN、LN等）有密切的关系[24]。但ECM成分与肿瘤淋巴管生成的关系很少有报道。氨基多糖透明质酸（hyaluronan，HA）是一种重要的ECM成分：它不仅可以吸收大量的水分子作为组织空间的“填充者”，而且可以结合ECM中的多种蛋白多糖而成为ECM的“组织者”；此外，它还可以通过细胞膜表面的受体（CD44、RHAMM等）活化细胞内的信号转导途径来调控细胞的增殖、运动和调亡等[25]。选取ECM中的HA来研究其与肿瘤淋巴管生成的关系，原因主要在于：许多研究表明ECM中HA的含量与肿瘤的转移有关，而且HA可以促进肿瘤细胞的许多恶性行为，例如肿瘤细胞的运动、金属蛋白酶分泌以及肿瘤血管生成等。其中，HA与肿瘤血管生成的关系尤为引人注目。研究发现HA低分子量的降解片段具有诱导血管生成的作用[26]。但是，关于HA是否同样可以影响经常与血管生成相伴随的淋巴管生成，至今尚无报道。此外，还有一个重要原因是HA与淋巴管系统有密切的关系——组织中的HA需要进入淋巴管内并随淋巴液的流动到达淋巴结内进行降解，因此淋巴管功能对HA的新陈代谢十分重要[26，27]。在淋巴管内皮细胞的表面存在HA的特异性受体LYVE-1（lymphaticendothelialhyaluronanreceptor-1）[28]。虽然LYVE-1的分子功能还未得到完全阐明，但LYVE-1与HA的另一个受体CD44（即淋巴细胞归巢受体）高度同源。而血管内皮细胞上CD44的活化可以诱导血管内皮细胞的增殖、运动和管腔的形成。这使得LYVE-1在肿瘤淋巴管生成中的作用尤其值得关注[29,30]。此外，HA进入淋巴管到达淋巴结内降解的过程，与肿瘤细胞的淋巴结转移有着相同的路径。四．实验部分1．MN-MCM-41的合成称量0.437gCTAB溶于180ml水中，常温磁力搅拌15分钟，然后加入0.24gNaOH，继续搅拌。在剧烈搅拌下，逐滴添加2.083gTEOS，此时开始出现白色沉淀。继续搅拌10分钟后，加入称量好的0.625g氯化锰。接着采用保鲜膜封口，磁力搅拌8个小时，然后用去离子水6000转，5分钟洗涤离心3次。为了去除CTAB模板剂，将制备好的样品加入50ml无水乙醇和0.3g硝酸铵，60℃下回流一个小时，再用6000转，5分钟乙醇洗涤三次，随后在60℃烘箱中烘干24小时。2．MN-MCM-41-NH2的合成称量0.5g的MN-MCM-41加入到含有60ml甲苯的烧瓶中，磁力搅拌10分钟后，加入550μLAPTES，磁力搅拌8h，随后用无水乙醇6000转，5分钟洗涤离心3遍，随后分散在50ml去离子水中。3．MN-MCM-41-NH2-HA的合成将含有MN-MCM-41-NH2的水溶液磁力搅拌十分钟，随后加入0.204