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一、基础知识（一）提取DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。⑴DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出3.DNA等大分子的理化性质⑵DNA不溶于酒精溶液⑶DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性4、DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？当氯化钠的物质的量浓度为2mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为0．14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。⑵DNA不溶于酒精溶液⑶DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃而DNA在80℃以上才会变性③洗涤剂——瓦解细胞膜，但对DNA没有影响试剂：（二）DNA的鉴定条件：二苯胺沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色沸水浴现象：（一）实验材料的选取（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液（三）除去滤液中的杂质(纯化)（四）DNA的析出与鉴定二、实验设计（一）实验材料的选取从下列材料中选取2～3种原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌凡是含有DNA的生物材料都可以考虑但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2、植物细胞①植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等思考：加入蒸馏水的目的是什么？加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA）加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA思考：这个步骤过滤获得什么？获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）1.DNA的溶解性（三）除去滤液中的杂质方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。思考：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？目的是使DNA充分溶解思考：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？含DNA的滤液思考：这一步过滤的目的是？含DNA的滤液，除去不溶的杂质DNA的析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.1～0.2mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。注意：在析出DNA的黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加思考：加蒸馏水的目的是？调节NaCl溶液物质的量为接近0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出思考：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物思考：这一步过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L的NaCl溶液，获得什么？获得DNA黏稠物（纱布上的DNA黏稠物）思考：过滤的目的？获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离（四）DNA的析出与鉴定与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物——粗提取DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA2.DNA的鉴定⑴向两支试管中分别加入2mol/LNaCl溶液5ml⑵其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解⑶向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml⑷混匀后，置于沸水浴中加热5min⑸待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象：溶解丝状物的溶液变为蓝色1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。三、操作提示•⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液•获得含核物质的滤液•⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液•获取纱布上的DNA粘稠物•⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液•得到含DNA的滤液本实验中有三次过滤,获得什么？•第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA•第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液•目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中•第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液•稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物•第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物•使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中•第五次搅拌体积分数为95%的酒精实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA本实验两次用蒸馏水第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA第二次：调节NaCl溶液物质的量为0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出本实验两次析出DNA第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物（利用DNA容易酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）实验成功的关键及注意事项1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够实验现象不明显的原因分析2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）