核酸分子杂交-(1)讲解

1分子生物学MolecularBiology核酸的分子杂交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology2碱基核苷核苷酸RNA腺嘌呤（A）腺苷腺苷酸(AMP)鸟嘌呤（G）鸟苷鸟苷酸(GMP)胞嘧啶（C）胞苷胞苷酸(CMP)尿嘧啶（U）尿苷尿苷酸(UMP)DNA腺嘌呤（A）脱氧腺苷脱氧腺苷酸(dAMP)鸟嘌呤（G）脱氧鸟苷脱氧鸟苷酸(dGMP)胞嘧啶（C）脱氧胞苷脱氧胞苷酸(dCMP)胸腺嘧啶（T）脱氧胸苷脱氧胸苷酸(dTMP)DNA和RNA的碱基﹑核苷和相应的核苷酸3核苷酸之间连接4DNA双螺旋结构5BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).6ContentofTable一、核酸分子杂交技术的原理二、核酸探针的制备三、核酸探针的标记四、核酸分子杂交技术五、DNA芯片技术7一、核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),与变性后的单链基因组DNA或RNA等进行杂交。用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表达丰度等。8910DNA变性是指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从而使核酸的天然构象和性质发生改变。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。11溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。增色效应。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。12复性指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。13应用：1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。14影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应151、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg，浓度过高影响杂交效率162、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃173、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度184、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交195、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性206、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉21常用于预杂交的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用小牛血清白蛋白。Home22二、核酸探针的制备探针（Probe):一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。23理想的探针1.要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测和鉴定杂交分子。2.应是单链，若为双链用前需要先行变性为单链。3.具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交，不与样本中存在的其它核酸杂交。4.探针长度一般是十几个碱基不等，小片段探针较大片段探针杂交速率快。5.作为探针的核苷酸序列要选取基因编码序列，避免用内含子及其它非编码序列。6.标记的探针应具有高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全。24(一）探针的分类据制备方法及核酸性质不同，可分为：基因组DNA探针（genomicprobe）cDNA探针（cDNAprobe）RNA探针（RNAprobe）寡核苷酸探针（oligonucleotideprobe)据探针标记物的类型不同：同位素标记的探针非同位素标记的探针251、Genomicprobe从基因组文库中筛选和纯化获得的一个特定基因（或基因片段）的克隆片段。多为某一基因的全部或部分序列（含有内含子序列），或某一非编码序列，或某一外显子序列。26①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。特点：27cDNA（complementaryDNA）是指互补于mRNA的DNA分子。这种DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。2、cDNAprobe28采用基因克隆或体外转录的方法获得。有些病毒的基因组是RNA，分离后经适当标记可制成RNA探针。3、RNAprobe29RNA探针优势杂交的效率高，杂交体较稳定。RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交较少。杂交后RNase将未杂交的探针分子消化掉，使本底降低。30寡核苷酸探针是采用DNA合成仪人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。一般长度为20～50个碱基。亦可根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。4、oligonucleotideprobe31探针的制备方法探针长度一般以50~300bp为宜。制备方法：1）利用DNA重组技术（基因组DNA探针制备）2）PCR扩增（cDNA探针制备）3）化学合成（寡核苷酸探针制备）32制备基因组文库细胞DNA酶切重组DNA筛选获目的基因转化细菌，培养存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary)。制备探针时，增殖细菌，扩增、提取质粒，用限制酶切，回收特定基因片段，经标记则成为基因组DNA探针。33ConstructionofaHumanGenomicLibrary34RestrictionEnzyme-ActionofEcoRI35DNArecombination36cDNA探针制备逆转录合成cDNA分离纯化mRNAPCR扩增37根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段或根据蛋白质氨基酸序列推导出核酸顺序加以人工合成。化学合成（寡核苷酸探针制备）Geneticcode38合成寡核苷酸探针注意原则：1）长度（18-50bp);2）G:C对含量40%-60%；3）探针内避免互补；4）避免同一碱基连续出现；5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。Home39三、核酸探针的标记为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。40（一）标记物1、理想标记物应具备的特性：1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同;2）特异性强、本底低、重复性好；3）操作简单、节时；4）安全、无环境污染。41放射性核素非放射性标记主要有：32P、35S、3H、125I、131I等。优点：灵敏度和特异性极高，可检出样品中少于1000个分子的核酸量。缺点：半衰期短，稳定性差，污染环境、检测需时较长。主要有：生物素、地高辛、辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶及FITC等。优点：具有稳定、安全、经济及实验周期短等特点，近年来应用越来越广泛。缺点：灵敏度低于放射性核素标记的探针2、标记的种类42（二）探针的标记方法放射性同位素标记法缺口平移法(Nicktranslation)随机引物延伸法(Randomprimerlabelling)末端标记法(Endlabelling)非放射性同位素标记法酶促标记法、化学标记法43缺口平移法的原理将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5`→3`聚合酶活性和5`→3`外切酶活性相结合。DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNApolI的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。44切口移位（平移）法454647随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。484950末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。51末端标记法5253非放射性同位素标记法光敏生物素标记核酸由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。酶促标记法将标记物预先标记在核苷酸分子上，利用酶促聚合反应将其掺入到待标记的探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到核酸分子上。54探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针5556核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针：放射自显影。非放射性同位素标记探针：偶联反应+显色反应。57放射自显影通过X光片检测放射性核素标记物。其基本原理为：同位素在不断衰变过程中释放出β-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影象，经过显影即可见到成像。581．偶联反应可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体