详细荧光定量PCR技术讲座

实时荧光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR)北京康为世纪生物科技有限公司RealtimeQuantitativePCRPCR：伟大的天才发明•UseofLSD•Synthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstances•BeliefinastrologyCYCLENUMBERAMOUNTOFDNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,000,000321,500,000,000331,550,000,000341,580,000,000PCR：理想与现实起点定量终点定量•起点定量检测：--起点量是样本中未经PCR放大之前的模板量--具有重现性，误差小--“加入了500个拷贝”•终点定量检测：-终点产物量经过PCR放大的DNA量--不恒定，误差大--“生成了500，0000，0000个拷贝”确定模板初始数量‘real-time’使qPCR成为可能起始模板量Ct值指数扩增期平台期Real-timePCR:检测原理非特异性荧光标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：TaqMan非水解探针：MolecularbeaconRQReporterQuencherRQ5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。SYBRGreenI工作原理Taqman工作原理在退火过程中，探针与靶序列结合探针被Taq酶的5’-3’外切酶活性剪切成片断游离报告基团发出荧光在延伸过程中，探针部分与靶序列分离荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。染料法与探针法对比探针法•特异性高--与探针与特异靶序列结合•对模板有选择性--可进行多重PCR反应•成本高--不同靶基因需要合成不同探针染料法•通用性好--对DNA模板没有选择性•使用方便，成本低--仅需设计两个引物•有假阳性现象--通过融解曲线判断Real-timePCR应用•基因表达分析--相对定量：基因表达量的差异--绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克）•基因型分析--SNP检测等位基因检测甲基化检测基因表达分析检测testsample处理样本targetgene目的基因referencegene内参基因totalRNAcDNAtotalRNAcDNAcalibratorsample对照样本targetgene目的基因referencegene内参基因qPCRqPCR以各自样本中内参基因为标杆，比较两样本中目的基因的相对丰度。数据分析内参基因的选择特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA等--文献检索--实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准内参基因HousekeepingGene--RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。对样本初始浓度差异进行均一化校正。不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。HousekeepingGene康为产品不同丰度：高丰度ACTB、GAPDH中等丰度beta2M低丰度HPRT1不同物种：人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗等基因表达分析检测•样本处理与RNA提取–cDNA–qPCR•内参基因(housekeepinggene)选择样本处理与RNA提取•外界刺激–10分钟–可检测的表达改变•样品离开定义环境–2分钟内–固定、裂解细胞–RNA样本保存液–Trizol–超纯RNA提取试剂盒•RNA的评价与鉴定-完整性-纯度•小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物设计-以RNA作PCR阴性对照CW0580CW0592CW0581CW2090ART-qPCR一步法还是两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。逆转录逆转录引物选择–下游应用：是否检测其它基因？–AbundantRNA的干扰：mRNAortotalRNA？–检测灵敏度是否足够？逆转录酶–SuperRT逆转录酶（RNaseH-）–HiFi-MMLV逆转录酶（RNaseH-）引物特异性反应效率OligodT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高CW0741CW0743总原则与普通PCR相同：避免引物二聚体，避免二级结构扩增片段长度（80–300bp)推荐做跨intron设计引物设计原则EXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA反应条件优化内参基因–目的基因--融解曲线：单一特异性产物--扩增曲线：Ct值--标准曲线：扩增效率尽量高，目的基因尽可能接近内参基因反应条件优化融解曲线分析--单一特异性产物将温度对荧光强度的变化求导图2Effciencyslope内参基因100%-3.32目的基因Primer278%-4.00图1Effciencyslope内参基因100%-3.32目的基因Primer195.36%-3.43标准曲线分析--扩增效率尽量高--目的基因尽可能接近内参基因10%以内反应条件优化反应条件优化扩增曲线分析--Ct值第一对引物ct=21.36第二对引物ct=25.14第一对引物ct=21.36第二对引物ct=25.14MasterMix的应用--热启动酶•化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95℃10分钟--GoldStar、HotStar•非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物）热复活仅需95℃几十秒--FastStar--Buffer•反应增强剂--减少引物二聚体，进一步提高反应特异性--对于复杂模板，提高反应效率•稳定剂--dNTPMasterMix的应用ROXPassiveReference•不参与、不干扰PCR反应•恒定发射荧光信号•用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。•需参照仪器要求选择。误差控制•使用Mastermix•配置预混体系•设置生物学重复（不同个体）技术性重复（复孔）•阴性对照荧光定量PCR体系2-ΔΔCt法满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10%2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110%相对定量数据分析1、目标基因的CT值-内参基因的CT值2、待测样本的ΔCT值-对照样本的ΔCT值3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的比值2-△△Ct法目的基因内参基因目的基因-内参基因△Ct待测样本-对照样本△△Ct倍数值fold2-△△Ct对照样本30.48523.6256.8601待测样本27.02522.664.365-2.4955.63728Troubleshooting常见问题可能原因解决方法Housekeepinggene无信号RNA降解用新鲜组织提取RNAHousekeepinggene有信号而目标基因无信号1.目的基因表达低。逆转录效率不高2.PCR引物不良1.富集mRNA2.在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3.尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体。4.尝试不同热循程序，降低复性温度。Housekeepinggene反应效率正常,但目标基因放大效率不高PCR引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体目标基因表达丰度在样本之间异常一致RNA被基因组DNA污染1.使用跨intron引物2.用DNase处理RNA3.确保RNA阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰1.出现非特异PCR产物2.出现引物二聚体1.尝试不同PCR引物2.尝试不同热循程序，升高复性温度3.修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。阴性对照在30个循环以内出现信号试剂被污染1.注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物查找，替换污染试剂2.使用UNG系统。荧光定量产品--染料法FastSYBRMixtureUltraSYBRMixtureGoldStarTaq特异性强灵敏度高Ct值更低线性范围更广定量更准确反应速度快比普通反应可节省约40分钟适合于普通和快速定量PCR程序荧光定量产品--染料法某其它品牌康为UltraSYBR--cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。--模板浓度进行10倍稀释，稀释6个梯度。康为世纪产品RNA--Trizol--超纯RNA提取试剂盒--动物组织RNA--植物RNA--血液RNA--病毒RNA逆转录--SuperRT/HiFi-MMLV逆转录酶--cDNA第一链合成试剂盒--RT-PCR一步法、两步法试剂盒荧光定量PCR--UltraSYBRMixture--FastSYBRMixture--GoldStarTaqmanMixturePCR--GoldStarDNAPolymerase--Taq/EsTaqDNAPolymerase--Taq/EsTaqMasterMixqPCR反应优化外包服务•Housekeepinggene–引物序列？反应条件？•目标基因–引物序列？反应条件？•选择试剂，摸索条件，优化参数–两个月？CoWin解决方案一：Primerassay–客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因–客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix–客户下游工作：Real-timePCR–数据获取CoWin解决方案二：全套qPCR服务–客户指定：物种，housekeepinggene，目标基因–客户提供：生物样本–客户得到：数据报告，剩余样品。–客户下游工作：写论文;得诺贝尔奖荧光定量培训班开班啦！培训内容：•荧光定量实验设计以及优化•数据处理及分析•学员亲自上机操作培训时间：2011年6月18日2011年6月25日北京康为世纪生物科技有限公司总机：010-58851919免费电话：4006-222-360网址：@cwbiotech.com