生化技术-电泳技术

一电泳的基本原理电泳分离：移动方向：带电性质决定泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。μ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt影响μ的因素：1颗粒本身：带电、大小、形状2外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。牛牛文库文档分享二纸电泳以滤纸为支持体的电泳技术操作要点：1选择缓冲液对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响A分离蛋白质，pI≈5，选pH8.6的缓冲液（巴比妥缓冲液pH8.6、硼酸pH8.6、磷酸pH7.4)B分离氨基酸：邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸，pH5.9C分离核苷酸巴比妥－醋酸pH2.5，柠檬酸pH2~3D分离糖类：HAC-NaAC,pH3~5牛牛文库文档分享2滤纸的选择与处理层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。3点样点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）干法、湿法4电泳电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间5显色及分析蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红BAa：茚三酮、靛红核酸：紫外光下观察一般洗脱定量牛牛文库文档分享三薄膜电泳支持体：薄膜优点：分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析操作1薄膜的处理与放置2点样平衡3电泳：E10~25V/cm，0.5～2h4显色牛牛文库文档分享四薄层电泳将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等操作：1缓冲液选择离子强度较高的缓冲液2支持物处理精制品3薄层板制作4加样：挖沟、混合样品、填埋5电泳6分析：印染法牛牛文库文档分享五凝胶电泳支持物：多孔凝胶聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳牛牛文库文档分享1聚丙烯酰胺凝胶的制备丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：（1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）（2）核黄素（VitB2）＋光改变单体浓度可改变凝胶孔径交联剂对孔径有影响：5％最小根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。牛牛文库文档分享2不连续电泳中样品压缩成层的原理不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液：样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液浓缩胶：与样品胶相同分离胶：小孔径，pH8.8～8.9Tris-HCl缓冲液牛牛文库文档分享样品压缩成层原理：电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸HCl→(解离）→Cl－，Cl－泳动速度最快（快离子）CH2(NH2)COOH→(样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8）→CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子）蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间电泳时，Cl－超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测），CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P，P在均一的电位梯度和pH条件下分离凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，P电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。分离测定：测分子量（与标准蛋白比较）鉴定样品纯度（条带数目）测定样品P含量：扫描定量（比色）牛牛文库文档分享凝胶电泳的操作要点1凝胶制备2电极缓冲液3样品处理及加样4电泳5染色与固定6脱色7分析牛牛文库文档分享六等电点聚焦电泳电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。P进入时，不同的P移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的P得以分离。优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的P。牛牛文库文档分享1稳定的pH梯度的形成2两性电解质载体要求：由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体）3支持pH梯度的介质密度梯度溶液（用于自由电泳）凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）4操作要点pH梯度支持介质的制备聚焦电泳检测两性电解质载体的除去牛牛文库文档分享电泳技术思考题1名词解释电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、相对迁移率、不连续凝胶电泳2影响泳动度的主要因素有哪些？3区带电泳的操作步骤一般有哪些？4如何制备聚丙烯酰胺凝胶？5不连续电泳样品压缩成层原理。6SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。7采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？牛牛文库文档分享