实验 -薄层色谱法

2020/3/51实验3薄层色谱法2020/3/521.了解色谱分离的原理及其应用。2.初步掌握薄层色谱的操作技能。目的和要求2020/3/53色谱法概述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。2020/3/54色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。色谱法原理2020/3/551.按固定相所处的状态分类：薄层色谱（ThinLayerChromatography）柱色谱（ColumnChromatography）纸色谱（PaperChromatography）2.按分离机理分类：吸附色谱（AdsorptionChromatography）分配色谱（PartitionChromatography）离子交换色谱（IEC）凝胶色谱（GPC）分类2020/3/566如上色谱都属吸附色谱类型，用固体吸附剂作固定相，以不同溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离仪器分析实验高效液相色谱(HPLC)气相色谱(GC)2020/3/57色谱法三要素吸附剂（固定相）：用于与样品发生吸附作用的固定不动的物质。在混合物样品流经固定相的过程中，由于各组分与固定相吸附力的不同，就产生了速度的差异，从而将混合物中的各组分分开。2020/3/58⑴氧化铝（alumina）氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的活性分为五级。吸附色谱三要素－吸附剂2020/3/59*酸性氧化铝（pH＝5-4），适用于分离酸性化合物和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨基酸类等。*中性氧化铝（pH＝7.5），适用与分离生物碱、挥发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。*碱性氧化铝（pH＝9-10），适用于碱性，如生物碱和中性化合物的分离。吸附色谱三要素－吸附剂2020/3/510⑵硅胶silicagel它的吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键的羟基。羟基有结合型（Ⅰ）、活性型（Ⅱ）和游离型（Ⅲ）三种吸附色谱三要素－吸附剂2020/3/511活性氧化铝含水量（％）硅胶含水量（％）Ⅰ00Ⅱ35Ⅲ815Ⅳ1025Ⅴ1538吸附色谱三要素－吸附剂2020/3/512洗脱剂（流动相）：也称展开剂，在色谱过程中起到将吸附在固定相上的样品洗脱的作用。乙酸吡啶水醇类（甲醇乙醇正丙醇）丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯环己烷正己烷石油醚*从前到后-洗脱能力降低。2020/3/513试样：在给定的条件下，各个成分的分离情况，与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下列顺序增加：Cl,Br,IC=COCH3CO2RC=O,CHO-SH--NH2-OH-CO2H结论：若样品极性越小，或流动相极性越大，样品在固定相上的移动速度则越快。2020/3/514在吸附层析中，试样、洗脱剂和吸附剂三者关系。它们三者的关系如下图。Stahl简图（1）离化合物的极性；（2）吸附剂的活度；（3）展开剂的极性。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角A指向极性物质，则角B指向活度小的吸附剂，角C就指向选用极性展开剂；A’,B’,C,处则是合理的选择组合。15有机化学中的应用*分离混合物：一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。*精制提纯化合物：有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。2020/3/516*鉴定化合物：在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。*跟踪一些化学反应进程：可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。2020/3/517薄层色谱薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。2020/3/518一、实验步骤1.薄层板的制备2.展开剂的选择3.点样4.展开5.显色6.比移值干铺法倾注法紫外光显色法碘蒸气显色法试剂显色法2020/3/5191.制薄层板硬板制备：50mL烧杯中放置10g硅胶GF254，逐渐加入5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液7mL，调成均匀的糊状。将其涂于三片玻璃板（7.5×2.5cm)上，室温放置半小时后，放入烘箱中在110℃恒温半小时，即制得硬板。202.点样样品准备：1.偶氮苯的纯化样品：1%偶氮苯溶液；展开剂：9:1石油醚/乙酸乙酯1:3石油醚/乙酸乙酯2.苏丹Ⅲ的纯化样品：1%苏丹Ⅲ的溶液；展开剂：9:1石油醚/乙酸乙酯1:3石油醚/乙酸乙酯3.混合样品的分离样品：1%偶氮苯和1%苏丹Ⅲ溶液混合样品展开剂：9:1石油醚/乙酸乙酯2020/3/521点样操作：1.可利用铅笔画一条线；2.样品溶液要点在0.7-0.8mm处；3.采用多次点样时，应待前一次点加的溶剂挥发后再进行;4.点量应适中，避免斑点拖尾;5.配制样品的溶剂具有挥发性和小极性。2020/3/5223.展开选洗脱剂可利用微量圆环技术；配制样品的溶剂具有挥发性和小极性，以免斑点扩展,不利于分离;洗脱剂的高度不超过0.5cm,以免样品被洗脱剂扩散；微量圆环技术1用环己烷展开2用苯展开3用氯仿展开2020/3/523展开槽普通展开槽双底展开槽2020/3/524多次展开—一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。梯度展开—混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。二维展开—在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90的方向进行展开。2020/3/525原点122020/3/526薄层色谱示意图12-132-22-32-42020/3/5274.显色及数据记录物理方法—紫外光下显示荧光或荧光淬灭。化学方法—加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏、线性良好。碘蒸气法—灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。*样品均有颜色，可直接观测，故本实验不需显色。*每个样品均需记录Rf值，列表记录。2020/3/51.板点样需很轻，否则固定相会粘到点样管下方。2.一根点样管只能点一种样品，否则有交叉污染。3.样品点直径应不超过2mm，样品点决不能浸到展开剂中。4.展开剂离薄层板上缘约0.5cm时应停止走板，取出晾干。不可使展开剂走到板的尽头。板取出后要及时标记展开剂前沿，否则展开剂挥发后难以确定。28二、注意事项2020/3/5291.展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影响？2.如何利用Rf值来鉴定化合物？3.为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？三、思考题