第二章--薄层色谱分离技术

第二章薄层色谱分离技术第一节薄层色谱概论第二节制备薄层色谱第三节离心薄层色谱第四节制备型加压薄层色谱第一节薄层色谱概论薄层色谱(Thin-LayerChromatographyTLC)是快速分离、定性和定量分析的一种非常重要的色谱技术。它是将固定相涂布于玻璃，铝铂，塑料片等载板上形成一均一薄层。将被分离的物质点加在薄层的一端，置展开室中，选用适当的展开剂，借毛细作用从薄层点样的一端展开到另一端，使性质不同的物质得以分离。一、TLC的分离原理分离原理随所用固定相不同而不同，可分为:(l)吸附薄层色谱采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的目的。(2)分配薄层色谱由硅胶、聚酰胺和纤维素铺成薄层，不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。(3)离子交换薄层色谱由含有交换活性基团的纤维素铺成薄层。(4)分子排阻薄层色谱也称凝胶薄层。利用样品中分子大小不同、受阻情况不同加以分离。(5)亲和薄层色谱利用酶、受体、抗原抗体特异性识别作用。二、TLC的技术参数1.比移值:一个化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值（Rf值）。是薄层色谱的基本定性参数。2．相对比移值(Ri，s)由于影响被分离物质在薄层上移动距离的因素较多，因此Rf值的重现性较差，如果将被分离物质与一参比物点在同一块薄层上，用相同的色谱条件进行分离。相对比移值就是被分离物质(s)和参比物(i)的Rf值之比，或是被分离物质(s)和参比物（i)在薄层上移动距离之比.由于参比物的Rf值或移动距离可大于或小于被分离物质的Rf值或移动距离，因此相对比移值可大于或小于l，但其重复性及可比性均优于Rf值。Ri,s=Rf(i)/Rf(s)三、TLC的应用特点：TLC不仅适合于小量样品的制备，也可用于较大量样品的纯化。如果将薄层加宽加厚，把样品点成一条线，能分离几百毫克样品。尤其是对于Rf值相近的物质的分离。TLC除了用于分离外，更主要的是通过与已知结构化合物相比较，来鉴定少量有机混合物的组成。此外,经常利用TLC寻找柱色谱的最佳分离条件。常用的两种制备型薄层色谱包括：传统的制备薄层法（PTLC），即流动相借毛细作用流经固定相。借外力强制性的使流动相流经固定相，如离心薄层和加压薄层。第二节制备薄层色谱(PreparativeThinLayerChromatographyPTLC)一、固定相及载体二，粘合剂与添加剂三、薄层板的制备四，上样五、展开剂选择六、薄层展开七、检测方法八、被分离物质的收集九、PTLC分离化合物的纯化经典的制备型薄层色谱，设备简单，操作方便。薄层色谱与常压柱分离配合使用，仍然在实验室中有较多的应用。尤其是在一些没有现代分离手段的实验室中广为使用。一、固定相及载体1．固定相：薄层色谱必须将被分离物质点于固定相上进行分离，固定相要根据被分离化合物的性质来选择。分离亲脂性化合物常常选用硅胶，氧化铝，乙酰纤维素及聚酰胺。分离亲水性化合物常常选用纤维素，硅藻土及聚酰胺。但也有例外，脂溶性叶绿素在氧化铝及纤维素上均能得到较好的分离。2．载体：玻璃板，铝箔，塑料片等（吸附薄层）；纤维素，硅藻土（分配薄层）（1）．硅胶：是最常用的薄层固定相，90％以上分离工作都应用之。１）普通型硅胶：无定型多孔粉末，表面带有硅醇基，呈弱酸性。因为有一羟基(silanolSi-OH)，呈弱酸性（PH=4.5）,通过硅原子上的羟基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键，所以表现为吸附性能。硅胶吸附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在150℃活化后失水提高活度，此时约有4－6个硅醇基/nm2,。（温度大于500℃，硅胶脱水形成硅醚（Si－O-Si）,而失去吸附能力）。—活性硅胶适合分离酸性或中性化合物，如酚类，醛类，生物碱类，甾体及氨基酸类，是基于吸附作用；—非活性硅胶含有一定量的水分，在分离色素等时，是基于分配作用。２）改性硅胶：借化学反应，将有机分子键合在硅羟基上，故称化学键合固定相。可分为极性键合相和非极性键合相。①极性键合硅胶：含极性基团（如氰基，氨基，二醇基），与普通硅胶相比活性低。一般作正相色谱，用非极性或极性溶剂为展开剂②非极性键合硅胶：键合相表面为极性极小的烃基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是18烷基键合硅胶。用极性较大溶剂为展开剂或无机溶剂为展开剂。因为Rf与正相色谱相反，故称反相薄层色谱法。3)硅胶的粒度与孔径：硅胶的分离效率与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。原则上，粒度越小，分离效果越好。孔径（Å）或孔体积表示硅胶粒子孔的大小的尺度，与传递阻滞有关；表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的保留。4）硅胶薄层板的厚度普通薄层厚度为250μm,高效薄层板为200μm，制备薄层板厚度0.5-2mm5）市售硅胶及预制板规格（符号及含义）硅胶G:是含有13％煅石膏（gypsum）黏合剂的硅胶硅胶H：不含黏合剂的硅胶硅胶HF254：不含黏合剂，含有一种无机荧光剂（如锰激活的硅酸锌），在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光硅胶GF254：含有煅石膏黏合剂，含荧光剂，在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光硅胶HF254+366：不含粘合剂，在254与366nm波长有荧光硅胶PF254：制备型的，在254nm有荧光（有荧光剂，适用于不发光不易显色物质的制备与分离）2．氧化铝：在薄层中其应用仅次于硅胶。由氢氧化铝400－500℃煅烧而成。广泛的用于萜类，生物碱，脂肪类，芳香类化合物的分离。因制法和处理方法不同可分为碱性，酸性，中性三类⑴碱性氧化铝：PH9－10适于中性、碱性化合物的分离⑵酸性氧化铝：PH4－5适于酸性化合物的分离⑶中性氧化铝：PH7－7.5适于酸性或对碱不稳定的化合物的分离氧化铝因其含水量活性可分为五级。制备型薄层用氧化铝选用2－3级市售氧化铝：Ａ．含10％G，PH7.5－8；Ｂ．不带粘合剂的氧化铝PH=9,也可加入波长254nm的荧光指示剂。3．纤维素与纸层析相似，按分配的原理。纤维素分子是由大量纤维二糖通过糖苷键连接的，由于有许多的OH基，所以具有亲水性。一分子水与与纤维素的两个羟基结合，形成“纤维素－H2O”络合物。这种固定相可以视为一种多糖浓溶液，即使使用与水相混溶的溶剂时，仍然形成类似不相混溶的两相。层析用纤维素分：普通纤维素乙酰化纤维素离子交换纤维素4．聚酰胺：聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物，薄层色谱中常用的是聚己内酰胺。聚酰胺分子内有许多酰胺基，酰胺基中的碳基与酚类、黄酮类、酸类中的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与酮类或硝基化合物形成氢键，同时由于所分离混合物结构不同，含羟基等活性基团的数目和位置不同，因而形成氢键的能力不同，所以对这些化合物的吸附能力不同而得到分离。5．葡聚糖凝胶分子筛的原理(1)亲水性葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷，dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂使葡聚糖交联聚合而成．其商品名为Sephadex，加入交联剂量不同可制成不同交联度的凝胶．交联度越大，网状结构越紧密，吸水时膨胀体积越小．用于薄层色谱的凝胶粒度要细，小于40um,交联度要低，G－50以下．(2)亲酯性萄聚糖凝胶萄聚糖凝胶只能用于水溶性物质的分离鉴定。但在葡聚糖分子上引入有机基团，则可使之成为亲脂性葡聚糖凝胶，如在G—25凝胶上引入羟丙基基团，与糖分子以醚键相连，使之成为既有亲水性又有亲脂性的LH—20葡聚糖凝胶，适用于有机物如黄酮、蒽醌、色素等成分的分离。6.离子交换剂葡聚糖凝胶离子交换剂在G—25或G—50葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙基及季铵乙基等而制成的既具凝胶的优点又具离子交换性质的载体，在生化及天然化合物方面得到广泛应用。7．硅藻土硅藻土商品名celite，是高度多孔的，比表面积大的固体，本身具极弱的吸附力，常作为分配色谱用的载体；或以一定比例加入硅胶等吸附剂中可以降低硅胶的吸附力，而有利于某些化合物的分离。二，粘合剂与添加剂为使薄层牢固地附着于支持体上需加合适的粘合剂;为特殊的分离检出有时要在固定相中加入某些添加剂.理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强，且具有化学惰性1，煅石膏将石膏（CaSO4.2H2O）在120－140℃烤2－4小时，过200目筛，备用。用煅石膏作粘合剂的优点是能使用腐蚀性的显色剂；但其缺点为薄层的硬度不够，且不利于无机物的分离。2，羧甲基纤维素钠CMC-Na先将羧甲基纤维素钠调成糊状，再加足量水搅拌均匀，并加热煮沸使尽可能溶解，放置澄清后，取上清液代替水与吸附剂搅匀涂布薄层。常用的浓度为0.2％--1．0％，浓度越高,薄层硬度越大，是常用的粘合剂，但其缺点为不能耐受有腐蚀性的显色剂。3，淀粉将淀粉配成5%的溶液,在85℃加热至有粘性,加入适量吸附剂制成薄层.缺点为不能耐受有腐蚀性的显色剂。4，预制板粘合剂上述三种粘合剂均于实验室自制TLC时使用．商品市售预制板粘合剂有：聚乙烯醇，聚丙烯醇，聚丙烯酰胺。5.添加剂荧光剂;酸、碱或PH缓冲液等。三、薄层板的制备当前国外商品化的各种预制板均有市售，可满足各种需要。（除个别特殊需要人工制板外）预制板使用方便,涂布均匀,薄层光滑及有很好的牢度.预制板有玻璃板、塑料板或铝箔板，后两种还有剪裁方便之优点。国外市售预制板较多，包括普通薄层预制板（硅胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、聚酰胺、离子交换纤维素、键合硅胶反相板）；高效薄层预制板（、键合硅胶预制板、手性预制板）等，规格众多，尺寸不同，分离效果及重现性均较手工制板好。国内预制板规格类型较少，进口又贵，所以主要靠自己手工制作。1，载板的制备：常用载板主要为玻璃板，塑料板，金属铝箔等较少应用载板必须是表面光滑，平整清洁玻板大小视实验所需而定。一般分析用：3×5cm；4×20cm；10×10cm,制备用：20×20cm，20×40cm2，薄板涂铺方法（1）干法铺板将吸附剂直接倒在板上一端，取一适当玻棒两端包裹上适当厚度的橡皮膏或塑料管，视薄层厚度要求而定。用力移动玻璃管，（用力不可过猛或太快，也不能中途停止，以免薄层厚薄不均）如此制成的薄板称为软板。由于该板易吹散，现已比较少用，多用硬板。（2）湿法铺板：一般都要加黏合剂，故称粘合薄层板（硬板）。常用两种硬板为：硅胶+G、硅胶+CMC-Na硅胶G板铺制。G的含量为10－13％，制板时每份硅胶G+水2－3份，研成糊状，倒在板上铺布。硅胶CMC-Na板铺制:硅胶H或硅胶G+CMC-Na水溶液（0.5％）（1：3），研成糊状，倒入板上铺布。0.5％CMC-Na配制：取适量CMC-Na+蒸馏水加热煮沸，完全融解，放冷静置。铺板时取其上清液使用。铺板时为了防止由于搅拌而带入气泡，常常加入少量乙醇或丙酮或将吸附剂糊首先置于真空干燥器中减压脱气，以免薄层表面出现气泡，影响分离效果。其他一些加黏合剂铺层的处理方法见有关参考书。湿法铺板方法操作：①倾注法：取适量调好的吸附剂糊，倒在干净的薄板上用玻棒涂成一均匀薄层，再稍加震动，使薄层平整均匀。置水平台上晾干，严防灰尘沾污。再置烘箱中110℃活化一小时，置干燥器中备用。本法均匀度较差，一致性差，适于小板的制备.②平铺法：在水平的较大玻璃上放上要铺的薄板。薄板两边加上做好的框边，倒上吸附剂糊，用一玻璃板或玻棒向一个方向均匀的将吸附剂刮平，然后轻轻震动均匀，置于平台上晾干，活化备用。适于大板的制备。（3）机械涂铺法：手动涂布器，自动涂布器。由于手动推进速度不同，使厚度不均匀。铺板机国产进口皆有，可调节制成厚度不同的薄层，供分析与制备用。刮板厚度分别为：0.3,0.4,0.5和0.6mm(固定相干燥缩水后的相应的薄层厚度为:0.15,0.2,0.25和0.3mm)一般用于分析的薄层厚度为0.25－0.5mm,用于制备的薄层