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重组质粒的构建（beta版）一、引物设计:1.选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stopcodon）。2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。1，使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。2，设计引物：primer-up：---------Primer-down：-----------3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。引物长度约20个碱基。4，核对----送公司合成。5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。二、PCR（P出目的片段）：（一）、PCRP出目的片段：2,pcr:cDNA1ul10xPFUbuffer2.5ul94℃5mindNTP1ul94℃30secF’-Primer1ul58℃30secR’-Primer1ul72℃XminPFU0.5ul72℃5mindd2H2O18ul（X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：0.6g琼脂糖60ml1XTAE0.6ul(待温度降到50-60℃左右时)保护碱基上游酶切位点首位20个碱基保护碱基下游酶切位点末尾20个碱基的反向互补碱基PCR(25ul)反应体系PCR温度体系30cycles1%的琼脂糖胶：大块25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，胶回收（胶回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，ElutionBuffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloadingbuffer2ul、dd2H2O5ul。三、酶切、链接：1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活）insert(胶回收产物)10ul10xbuffer2ul20ul的体系dd2H2O6ulEcoRI1ulHindⅢ1ul2，载体酶切：（1~2小时）Vector（1ug/ul）：5ul（总量5ug）10xbuffer2ul20ul的体系dd2H2O11ulEcoRI1ulHindⅢ1ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4，连接：10xT4LigationBuffer1ulVector1ul10ul体系insert3ul（2～3ul）T4DNALignase1uldd2H2O4ul附：LigationsystemDNA片段克隆到质粒载体上载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA和基因组DNA克隆载体。可根据以下公式计算插入DNA用量：[实例]:载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：四、转化：{⑴、冰上30min-→热激：42℃、60秒（30～60s）-→冰上2分钟⑵、加750ulLB，37℃、150rpm、45分钟。⑶、离心，4500g,5min。吸去上清600ul，余150ul涂板⑷、220rpm、过夜。五、挑克隆六、质粒提取（mini）(按试剂盒protocol)七、酶切鉴定：plasmid：5ul（总量5ug）10xbuffer1ul10ul的体系dd2H2O2ulEcoRI1ulHindⅢ1ul跑胶检测酶切后DNA条带位置（分子量）是否一致八、测序九、质粒提取（midi）十、转染、Westernblot(检测蛋白表达及表达条带是否符合)感受态细菌50ul质粒5ul（2~5ul）