重组质粒的构建.

重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3基因提取—1、2、3PCR反应扩增目的基因—4、3PCR反应扩增目的基因—4、3DNA片段回收—5、3DNA片段回收—5、3重组质粒检测：（1）PCR(2)双酶切—8、5重组质粒检测：（1）PCR(2)双酶切—8、5测序测序重组质粒提取—2、3重组质粒提取—2、3菌种保藏—7菌种保藏—7目的片段与载体连接及转化—6目的片段与载体连接及转化—6实验操作1、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（YeastExtract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone）1g酵母提取物（YeastExtract）0.5gNaCl1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。5、LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心2min）【注：rmp（转速）与rcf=×g（相对离心力）,RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。】3、加入250ulSolutionⅠ（使用前加入RNaseA1，冰箱4℃冷藏），充分悬浮细菌沉淀。【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex等剧烈震荡使菌体充分悬浮。】4、加入250ulSolutionⅡ【裂解细胞】（提前放入37℃孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合5—6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。【注：此步骤不宜超过5min】5、加入350ulSolutionⅢ【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合5—6次，直至形成紧实凝集块。6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min离心。7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。8、加入500ulbufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。9、加入700ulDNAwashbuffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。（重复一次）10、空离，13,000xg，2min离心。11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。12、加入60ulddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。13、13,000xg，1min离心，得液体。14、测浓度。15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20℃保存。】3ul质粒（DNA）10xLoadingBuffer1xTAE3ul1ul6ul6ul质粒（DNA）10xLoadingBuffer20ul2.2ul三、琼脂糖凝胶电泳【试剂】琼脂糖（Agarose），1xTAE电泳缓冲液，染料（SyBRSafeDNAGelStain）,DL2000DNAMarker,10xLoadingBuffer【实验步骤】1、配置50ml（大样）、25ml（小样），1.5%的琼脂糖凝胶。称取50x1.5%=0.75g琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml1xTAE缓冲液，染料2ul（边加染料边倒TAE缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。（一般中低档，5min）3、插入梳子，倒入制胶槽中。4、放在抽屉里室温、避光静置20min。5、按下表加样。适用于检测DNA（小孔）：Marker（DL2000）样品适合回收DNA(大孔)Marker（DL2000）样品6、120V，电泳25min左右。7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。新建→选染料（SyBRsafe）→选颜色（SyBRGreen）→勾除高亮选项→检测→文本注释(字体14，颜色白色)→保存（酶切后的质粒会出现两条色带，上面的一条是载体较暗，下面的一条是目的质粒较亮，根据Marker显示，证明是否是所需质粒）【注】1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10xLoadingBuffer均加1ul。2、电泳的加样空宽度小于6mm时，每次取5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样空增宽，需适当增加Marker制品的加样量。3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。4、进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。6、若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。7、实验室有两种常用的Marker分别为DL2000DNAMarker和λ-EcoT14digestDNAMarker。琼脂糖电泳图像示意图如下：四、PCR【试剂】灭菌水、10xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS）、引物（上、下）TaqDNA聚合酶、模板DNA（质粒）【操作步骤】加样前应先打开PCR仪预热。1、在0.5mlPCR管中加入依次下列试剂：25ul体系（EGFP扩增）：灭菌水：9.5ulLA混合物：12.5上引物：1ul下引物：1ul模板DNA（PCDHA）：1ul总体积：25.0ul2、将上述PCR反应混合物放入PCR仪中。3、设定程序进行扩增：94℃变性5min后，开始以下循环94℃变性-----------------------------------------30s55℃退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）-----1min72℃延伸-----30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）共30个循环最后循环结束后72℃反应7min，4℃冷却。4、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。【注】1、当PCR反应后的产物目的片段还需要进行后续操作时，选用LATaq酶；当PCR反应用于检测时选用EXTaq酶。2、buffer的选择应与酶的选择相对应，例如：LATaq酶对应的buffer为10xLAPCRBuffer。3、在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。这样既节省时间，又节省枪头。五、PCR产物的回收纯化1、将PCR产物稍微离心片刻。2、将PCR扩增产物转移至1.5mlEP管中，然后加入4-5倍体积的BufferCP,若PCR产物200bp则加入6倍体积的BufferCP。3、充分振荡混合。4、然后转移至DNA离心柱中，10,000xg离心1min，倒回重复一次，弃液体。5、加入700ul的DNAWashBuffer，10,000xg离心1min，弃液体。6、空离，13,000xg，2min离心。7、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。8、加入15-30ulddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。9、13,000xg，1min离心，得液体。六、与T载体连接10ul体系2xRapidLigationBuffer，T4DNALigase5ulPGEM-TEasyVector（50ng）1ulPCRproduct（150ng）150/CulT4DNALigase1ulWater3-150/Cul总体系10ul放入4℃冰箱内过夜。七、DNA片段的回收纯化【实验步骤】1、实验前将水浴锅调到55℃-60℃，将灭菌水60℃水浴锅内预热。2、使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。3、在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA的回收率。（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤，先切后验证。）4、切碎胶块。5、向胶块中加入胶块融化液Bindingbuffer500ul。6、均匀混合后55℃-60℃加热融化胶块7min，此时应间断振荡混合。（注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA的回收率。）7、将上述胶块融化液倒入柱子内，10,000xg1min离心，倒回，重复一次。8、加入300ulBindingbuffer，10,000xg1min离心，弃滤液。9、加入700ulDNAwashbuffer，10,000xg1min离心，弃滤液。10、空离，13,000xg，2min离心。11、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。12、加入30ulddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。13、13,000xg，1min离心，得液体。八、目的片段与载体的连接及转化【试剂】PMD-18载体、目的片段、SolutionⅠ、感受态细胞、LB液体培养基（加氨苄青霉素抗体AMP）、含AMP的LB固体培养基【实验步骤】1、连接、实验前水浴准备。、在PCR管中加入：PMD-18载体1ul目的片段4ul总体积5ul、再加入5ul的SolutionⅠ、16℃，连接90min2、转化、全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40min。、42℃水浴锅内热激90s（让质粒进入感受态细胞）。、取出冰上放置5min（让感受态细胞关闭）。、加入200ulLB液体培养基（无抗体AMP），37℃摇床培养1h。3、涂板将上述培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。（3ml培养基中加入3ulAMP）4、挑菌第二天晚上五点左右挑菌，在5mlLB液体培养基（加5ulAMP）中摇床培养，37℃过夜。（5mlLB培养菌+5ulAMP+用枪头挑菌，枪头可打入培养瓶中）5、第二天提取质粒。或6、保藏、实验前超净台灭菌。、将500ul50%的甘油与500ul菌液混合，-80℃保存。九、双酶切反应【试剂】Buffer2.1、限制酶Ⅰ（EcoRⅠ）、限制酶Ⅱ（BstBⅠ）、重组质粒（plasmind）、灭菌水【实验步骤】1、实验前水浴准备。2、在0.5ml的PCR管中加入下列试剂：体系：灭菌水：20ul-V其他Buffer2.1：2ulBSA：0.2ul质粒：1ug/CEcoRⅠ：0.5ulBstBⅠ：0.5ul总体积：20ul（注：黑色加粗部分的体积不随总体系体积的变化而变化，既保持恒定不变。）3、37℃水浴，2-4h。4、琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物。【注】1、酶的选择：载体上有酶切位点，但目的片段上没有该酶的酶切位点，且选择的酶为常用酶。2、Buffer的选择：需要参考所选择的酶，必须同时适用于两种酶。相关资料请查询双酶切通用缓冲液使用表。例：若选用BamH