抗流感病毒药物研究进展

抗流感病毒药物研究进展流感病毒•流感病毒，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。病毒最早是在1933年由英国人威尔逊·史密斯（WilsonSmith）发现的，他称为H1N1。H代表血凝素；N代表神经氨酸酶。字母后的阿拉伯数字则代表抗原的类型。•根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群，其中人类流感病毒根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:•甲型流感病毒（InfluenzaAvirus），又称A型流感病毒•乙型流感病毒（InfluenzaBvirus），又称B型流感病毒•丙型流感病毒（InfluenzaCvirus），又称C型流感病毒•流感病毒结构自外而内可分为：包膜、基质蛋白以及核心三部分•核心•病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。流感病毒的遗传物质是单股负链RNA。•基质蛋白•基质蛋白构成了病毒的外壳骨架，实际上骨架中除了基质蛋白(M1)之外还有膜蛋白(M2)。M2蛋白具有离子（主要是Na+）通道和调节膜内PH值的作用，但数量很少。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。•包膜•包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，成熟的流感病毒从宿主细胞出芽，将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞，去感染下一个目标。•血凝素(HA)•呈柱状，能与人、鸟、猪豚鼠等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血，故而被称作血凝素。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。血凝素具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。•神经氨酸酶(NA)•是一个呈蘑菇状的四聚体糖蛋白，具有水解唾液酸的活性，当成熟的流感病毒经出芽的方式脱离宿主细胞之后，病毒表面的血凝素会经由唾液酸受体与宿主细胞膜保持联系，需要由神经氨酸酶将唾液酸水解，切断病毒与宿主细胞的最后联系,使病毒能顺利从宿主细胞中释放，继而感染下一个宿主细胞。因此神经氨酸酶也成为流感治疗药物的一个作用靶点，针对此酶设计的奥司他韦是最著名的抗流感药物之一。•神经氨酸酶•流感病毒特点：•流感病毒抵抗力较弱，不耐热，56℃30分钟即可使病毒灭活。室温下传染性很快丧失，但在0℃～4℃能存活数周，—70℃以下或冻干后能长期存活。病毒对干燥、日光、紫外线以及乙醚、甲醛、乳酸等化学药物也很敏感•发病机制：传染源主要是患者，其次为隐性感染者，被感染的动物也可能是一种传染源。主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。少数也可经共用手帕、毛巾等间接接触而感染。•病毒传入人群后，传染性强并可迅速蔓延，传播速度和广度与人口密度有关。进入人体的病毒，如果不为咳嗽反射所清除，或不为机体的特异IgA抗体中和及粘膜分泌物中非特异性抑制物灭活，则可感染少数呼吸道上皮细胞，引起细胞产生空泡、变性并迅速产生子代病毒体扩散至邻近细胞，再重复病毒增殖周期。病毒的NA可降低呼吸道粘液层的粘度，不仅使细胞表面受体暴露，有利于病毒的吸附，而且还促进含病毒的液体散布至下呼吸道，在短期内使许多呼吸道细胞受损。流感病毒一般只引起表面感染，不引起病毒血症。•流感病毒侵袭的目标是呼吸道粘膜上皮细胞，偶有侵袭肠粘膜的病例，则会引起胃肠型流感。•病毒侵入体内后依靠血凝素吸附于宿主细胞表面，经过吞饮进入胞浆；进入胞浆之后病毒包膜与细胞膜融合释放出包含的ss-RNA；ss-RNA的八个节段在胞浆内编码RNA多聚酶、核蛋白、基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶、非结构蛋白等构件；基质蛋白、膜蛋白、血凝素、神经氨酸酶等编码蛋白在内质网或高尔基体上组装M蛋白和包膜；在细胞核内，病毒的遗传物质不断复制并与核蛋白、RNA多聚酶等组建病毒核心；最终病毒核心与膜上的M蛋白和包膜结合，经过出芽释放到细胞之外，复制的周期大约8个小时。•流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎抗流感病毒药物•M2离子通道抑制剂•神经氨酸酶（NA）抑制剂M2离子通道抑制剂金刚烷胺金刚乙胺作用机制：通过阻断M2离子通道蛋白来阻止病毒脱壳,使病毒RNA不能释放到细胞质中,病毒的早期复制被中断,从而起到抗流感病毒的作用。由于M2蛋白产生的耐药株具有致病性和传染性，另外只有A型流感病毒才有M2离子通道蛋白,因而M2离子通道蛋白抑制剂的临床使用并不广泛。神经氨酸酶（NA）抑制剂•神经氨酸酶是一个非常有吸引力的靶标。由于构成NA活性位点的氨基酸序列在所有A、B型流感病毒中高度保守,不因病毒变异株的出现而改变结构或功能,加之流感病毒NA晶体结构的确定,使人们在微观上对分子与NA的相互作用有了详尽了解,为抗流感病毒药物的研究提供了有利基础。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•苯甲酸衍生物•环己烯衍生物•环戊烷衍生物•吡咯烷衍生物•天然提取物神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物NA活性位点NA的活性位点分成S1−S55个活性作用区域，N-乙酰神经氨酸类NA抑制剂环上C-2位、C-4位、C-5位和C-6位对NA的结合至关重要。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-2位取代基扎那米韦C-2位的羧基可与NA的S1区域形成盐桥,是活性的必需基团。但羧基的存在会增加分子的极性,降低药物的生物利用度。由于化合物极性比较大,因此需要吸入式给药。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-4位取代基C-4位为胍基取代的化合物,4-胍基取代后,形成了一个多原子探针,可与Asp151、Glu119、Glu227和Trp178产生强烈的分子间作用,使得该类化合物对流感病毒的抑制活性大大增强,且不易产生耐药性。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-4位取代基2006年,Li等合成了一系列4-位被三氮唑类化合物取代的化合物,发现化合物10的活性接近扎那米韦。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-4位取代基Tindal等合成了4-位由醚取代的一系列的衍生物,发现这类化合物对hPIV-3型病毒具有比扎那米韦更好的活性。2008年,Ye等报道了4位-4位相连的C2对称或不对称的唾液酸二聚体,可以作为非天然的唾液酸多聚体神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-5位取代基乙酰氨基是这类抑制剂的活性必需基团。Smith等在对5-位的乙酰基化合物的一系列修饰中,合成了一系列化合物,没有发现活性优于扎那米韦的化合物。2004年,Alymova等报道了BCX2855可以抑制副流感病毒(hPIV-3),但对流感病毒NA活性不明显。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-6位取代基•针对扎那米韦侧链C-7、C-8和C-9位的结构改造,是近几年研究的热点。Bamford等改造C-6侧链得到了不同链长的N-乙酰神经氨酸类似物,活性随羟甲基数目的增多而增大。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-6位取代基2002年,Honda等设计合成了7-烷氧基系列衍生物。活性测定发现,烷基的碳链小于12的化合物对A型病毒NA的抑制活性较扎那米韦的抑制活性强,当碳链长于12时,抑制活性显著降低。研究还发现,去除8,9-位羟基的衍生物活性大大降低,这说明了8,9-羟基在与NA的结合中的重要作用。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-6位取代基Masuda等为了提高NA抑制剂的口服生物利用度,还合成了一系列双环醚类NA抑制剂,这些化合物在细胞培养中显示出对A型流感病毒的抑制活性。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•C-6位取代基Yamashita等将NA抑制剂R-125489做成前药CS-8958,不仅抑制活性比扎那米韦和R-125489好,而且体内试验表明它是一个比扎那米韦更长效的NA抑制剂。R-125489CS-8958神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•扎那米韦多聚物2005年,Macdonald等报道了该二聚物用于预防和治疗病毒感染。研究表明:化合物21具有抑制N1亚型流感病毒活性,包括抑制高致病性流感染病H5N1A/Chicken/Vietnam/8/2004的活性。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•扎那米韦多聚物Watson等通过扎那米韦的7-位羟基的酰胺衍生物与含有多羧基的化合物缩合得到该系列衍生物。与扎那米韦相比,这些化合物在大大鼠体内的作用时间更长,而且活性更高。神经氨酸酶（NA）抑制剂•唾液酸类似物•扎那米韦多聚物最近,Wen等报道了以卟啉为骨架的扎那米韦四聚物L1，L2，L3,它们抑制NA的活性比扎那米韦稍弱,但使流感病毒失活的能力比后者要强。这些化合物通过扎那米韦部分与病毒的高亲和力到达病毒表面,卟啉载荷体发生光敏化反应,释放出高活性的单线态氧原子,氧原子直接作用于病毒表面的NA,使流感病毒失活。神经氨酸酶（NA）抑制剂•苯甲酸类衍生物•扎那米韦作为第一个上市的NA抑制剂,由于其极性比较大,口服生物利用度低,加之其通过吸入给药,没有口服给药方便,因此,开发口服有效、体内作用时间长的NA抑制剂成为近期药物研究的热点。其中,苯甲酸类衍生物因为形状与化学官能团都与唾液酸类似,与NA活性位点结合的方式也与唾液酸类似,而发展成为一类NA抑制剂。神经氨酸酶（NA）抑制剂•苯甲酸类衍生物1999年,Atigadda等发现在苯环3位引入亲脂性基团3-戊氧基,可以引起结构张力,使5位胍基与由Glu229、Asp152和Glu120残基构成的负电性口袋发生静电作用,而戊氧基在空间上与Glu278、Arg226、Ala246和Ile224残基构成的疏水性口袋结合,此化合物表现出对A型流感病毒NA的选择性抑制活性。可见,取代的苯甲酸与非芳香性抑制剂同NA的作用方式类似,苯环上的亲脂性基团和极性侧链可以提高对NA的抑制活性。神经氨酸酶（NA）抑制剂•苯甲酸类衍生物Brouillette等又报道了该吡咯烷基取代的苯甲酸类似物,对A型流感病毒NA表现出较好的抑制活性神经氨酸酶（NA）抑制剂•苯甲酸类衍生物由于三取代苯甲酸衍生物只占据了4个NA活性位点中的3个,为了提高其结合程度,Chand等报道了四取代的苯或吡啶衍生物系列NA抑制剂,用羟乙基和肟基来模拟甘油醇部分,但这些化合物对NA的抑制作用令人失望,可能是这些取代基的空间指向与甘油醇部分不同,并且可能会降低其他取代基与活性位点的结合强度。其中对NA抑制活性最好的四取代吡啶衍生物是此化合物。神经氨酸酶（NA）抑制剂•苯甲酸类衍生物2008年,Zhang等以对氨基水杨酸为原料,在2位引入亲脂性基团,合成了一系列对氨基水杨酸衍生物,对H3N2的抑制活性在32～49nmol·L−1(IC50)之间。分子对接实验表明2位新引入的亲脂性侧链与由Glu276、Glu277残基构成的疏水性口袋结合。神经氨酸酶（NA）抑制剂•环己烯衍生物奥司他韦Kim等以氧鎓离子过渡态为基础,用环己烯骨架替代二氢吡喃骨架,设计合成了GS4071及其前药形式的GS4104(奥司他韦,oseltamivir)。GS4071神经氨酸酶（NA）抑制剂•环己烯衍生物奥司他韦有效地弥补了扎那米韦口服生物利用度低、体内消除速率快的不足,优化了其药代动力学性质,是口服有效的抗流感药物。Kim等通过对奥司他韦与NA复合物的晶体研究发现:1-位的羧基、4-位的氨基和5-位的乙酰氨基与NA的作用与Yun等[49]报道的氨基羰基取代的作用类似,不同的是3-位的3-戊氧基这一亲脂性基团与Glu276、Ala246、Arg224和Ile222共同作用,而不像扎那米韦的甘油醇侧链只与Glu276发生双齿氢键螯合作用。在作用的过程中Glu276的羧基指向疏水口袋的外部。这一