基因敲除

1基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。例题(18分）1.基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：2该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞。用含_____________的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基______________所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）。（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入_______________体内，使其发育成嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与_________小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠。（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究________的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除________。答案：2.研究者取野生型小鼠（Ⅰ+Ⅰ+)的胚胎干细胞，转入含neor基因（新霉素抗性基因）的DNA片段，定向突变Ⅰ+基因（结果如图1),再将突变的胚胎干细胞移回野生型小鼠胚胎，培育出带突变基因（Ⅰ-）的杂合子小鼠。(1)将外源DNA片段导入胚胎干细胞后，需用含的培养基培养细胞，以筛选得到突变的胚胎干细胞。(2)用此杂合体小鼠与野生型小鼠进行杂交实验，并通过DNA分子杂交技术检测小鼠的基因型，结果如图2。3①检测小鼠的基因型，需根据序列设计DNA分子探针。根据杂交实验结果推测，I基因的功能是与有关。②分析系谱图(能/不能）判断Ⅰ+、Ⅰ-基因的显、隐性，理由是.③只有突变基因来自(父本/母本）时，杂合子小鼠才表现出发育迟缓，由此推测来自的I基因在体细胞中不表达。④提取小鼠体细胞的总RNA,加入Actin基因（编码细胞骨架蛋白）和netr基因的RNA探针，之后加入RNA酶水解单链RNA。若探针能与细胞样品的RNA结合成双链RNA则不被酶水解而保留，电泳分析时呈现明显条带（在记录实验结果时，有明显条带用“+”表示，无明显条带用“一”表示)。请将支持③推测的实验结果填入下表ⅰ、ⅱ、ⅲ处。(3)杂合子小鼠雌雄个体交配，则后代的表现型及比例为。答案(18分，每空2分）(1)新霉素(2)①外显子2和neor基因生长发育②不能杂合子小鼠既有体型正常的，又有发育迟级、体型瘦弱的，无法判断性状的显、隐性，所以也无法判断Ⅰ+、Ⅰ-‘基因的显、隐性③父本母本④ⅰ:一、ⅱ：+、ⅲ：一(3)野生型：发育迟缓型=1:13.（16分，除特殊说明每空2分，图解2分）4科研工作者利用胚胎干细胞和基因敲除技术改造老鼠体内的特定靶基因，使实验鼠体内的靶基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能，这种技术的应用，使我们能够更深入地了解胚胎发育、老化以及疾病的过程。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段（部分序列与靶基因相同，从而使该片段特异性插入靶基因）使靶基因突变而达到基因敲除的目的。原理如图：科研工作者获取稳定遗传的纯合体基因敲除小鼠一般经历下列过程：(1)获取干细胞悬浮液科学家将动物胚胎组织用处理使其细胞离散，再通过CO2培养箱培养胚胎干细胞。CO2的作用是；胚胎干细胞分化为不同组织器官的原因是。(2)构建重组DNA分子构建含有“同源性片段”的重组DNA分子时要用到的工具酶有；该实验病毒的作用是_____________。（3）获取含重组基因的干细胞基因转移的同源重组自然发生率极低（动物的重组概率为10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的标记基因作用非常重要，可采用__________________技术检测或利用选择培养基筛选。靶基因被插入同源性片段后发生基因突变，该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、化学诱发突变的______________特点，便于专一性研究靶基因的功能。（4）将重组的胚胎干细胞通过显微注射技术导入胚泡（囊胚中），然后将胚泡植入受体小鼠子宫中，获取子代嵌合体小鼠。其中一些子代小鼠的配子不含无活性基因，原因可能是________________________________________（答出2点）。X代中含有无活性基因的雌鼠和雄鼠5均为_________________。（5）获取基因敲除纯合子小鼠假设已获取1只雌性基因敲除杂合子小鼠。用遗传图解表示利用该鼠通过杂交实验获得纯合基因敲除小鼠的过程。（靶基因用A表示，插入同源片段的靶基因用A+表示）答案（18分，除特殊说明每空2分）⑴胰蛋白酶（1分）调节pH（1分）基因的选择性表达⑵限制性内切酶、DNA连接酶（缺一不可）载体⑶DNA分子杂交随机性和不定向性（1个1分）⑷子代小鼠可能为杂合子；重组胚胎干细胞未分化为精原细胞或卵原细胞杂合子⑸2.RNA干扰技术（RNAinterference，RNAi）引起的基因敲除：RNAi是一种普遍的转录后基因沉默的机制。由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。3.利用随机插入突变进行基因敲除利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同，逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言，农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。(1)T-DNA简介及相关例题T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构。另外，T-DNA也叫transferredDNA。是Ti质粒上的片断，T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱。T-DNA技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一。T-DNA是农杆菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。农杆菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。T-DNA是Ti质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（主要是双子叶植物）时分别诱发根瘤，opine化合物的合成和抑制细胞分化。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体，而外基因就是整合到T-DNA上的。一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任，而在众多的载体中目前仅有Ti质粒在转化植物受体方面取得较多的成功。所以Ti质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。农杆菌侵染植物后，Ti质粒中的T-DNA区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。因此，如果把外源基因插入T-DNA中，就有可能携带进入受体植物并整合到染色体上。自交P♀AA+×AA♂（1分）F1AA+AA（1分）F2A+A+2AA+AA（1分）解析：因为只获取1只雌性基因敲除嵌合鼠，所以第一步不能自交；F1获得多只雌、雄基因敲除嵌合鼠6例题1.（16分）利用农杆菌转化法，将抗逆基因转入至拟南芥（2n=10）中，获得不同株系的拟南芥。（1）从农杆菌中获得带有潮霉素抗性基因（H基因）的Ti质粒，将抗逆基因插入到Ti质粒的上，因Ti质粒上的此结构具有的特点。（2）为确定不同拟南芥株系导入的基因在染色体上的相对位置，科研人员筛选并通过自交获得转基因成功的4个纯合株系：1、2、3、4，做了如下杂交实验。①4个纯合株系植株分别与非转基因植株正、反交得F1，F1自交获得F2。F2中抗潮霉素性状与不抗潮霉素性状的植株比例为，表明每个株系的H基因均位于一对同源染色体上的同一位点，但不能确定4个株系的H基因是否位于同一对同源染色体上。②将上述4个纯合株系植株间进行配组形成6个杂交组合（1×2、1×3、1×4、2×3、2×4、3×4），每个组合得F1，F1自交获得F2。a．除2×4组合外，其它杂交组合F2中抗潮霉素性状与不抗潮霉素性状的植株比例均为15:1，表明1、2、3三个株系相比较，它们的H基因位于（同源染色体/非同源染色体）上。b．2×4组合F2植株全表现抗潮霉素性状。假设株系1中H基因在染色体上的位置如图1所示，请推测株系2中H基因的位置和株系4中H基因的两种可能的位置（在图2中标注，竖线代表染色体，横线代表基因的位置）。c．根据上述实验推测，利用农杆菌转化法导入到拟南芥中的基因的插入位置是（随机/固定）的。（3）潮霉素抗性可作为转基因植株后代具有抗逆基因的初步判断指标。实验中发现上述纯合株系自交后代的抗逆比例未达到100%，可能的原因是。答案（16分）（1）T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上（2）①3:1②a.非同源染色体b.（4分）株系2株系1HH图2株系4（第一种可能位置）株系4（第二种可能位置）图17c.随机（3）抗逆基因丢失或抗逆基因未表达（合理给分）2.（18分）科研人员将T-DNA片段（T-DNA的区段带有潮霉素抗性基因）插入正常株（野生型）水稻愈伤组织单个染色体DNA中，导致被插入基因（PIN蛋白基因）发生突变，得到矮杆水稻（突变型）Q。科研人员利用矮杆突变体Q进行自交得到F1：（1）统计F1代植株的株高，并剪取其叶片在含选择培养基进行筛选，统计实验结果如下表。潮霉素抗性F1植株性状矮杆正常株高抗性2580非抗性085据表分析，说明矮杆突变体性状是性性状，水稻的株高是由对等位基因控制的，判断依据是。F1矮杆植株自交得到F2，F2中矮杆性状所占比例为。（2）已有研究表明PIN蛋白与生长素的极性运输有关。研究者据此推测T-DNA片段的插入导致（选“矮杆水稻”或“正常水稻”）PIN蛋白基因的表达量，从而造成生长素的极性运输水平下降，植株中出现矮杆性状。（3）为验证上述推测，研究者首先需要从水稻叶片中提取总RNA，经过程获得cDNA；再根据PIN蛋白合成基因的设计引物，定量扩增PIN蛋白合成基因，得出样品中PIN蛋白合成基因转录出的mRNA总量；最终比较PIN蛋