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研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用的技术平台的技术平台梁洁科教部2006.8.12蛋白质相互作用的网络图谱生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物２００种蛋白质及２０００种组合结构进行解析后，发现其中三分之一的蛋白质相互组合会导致疾病，容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化l绝大多数疾病都是由１０万种以上的特定蛋白质相互作用所致l蛋白质－蛋白质相互作用和识别在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物个左右氨基酸构成，含有SH2结构域的蛋白质可以利用SH2结构域与其靶肽上磷酸化的酪氨基酸残基的高特异性的结合为调节细胞信号转导链，这种作用是序列特异的，且是磷酸化依赖的SH2结构域Mac2结合蛋白多见于细胞表面分子和一些分泌蛋白，功能是参与配体介导结合SRCR结构域凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf）在高等真核细胞G蛋白β亚单位中有8个随机重复序列，每个由40个氨基酸残基构成，而每一个都含有中央的Trp-Asp模块，因而称为WD40，该结构域可以介导蛋白质相互作用WD40结构域分裂后期启动复合体亚单位（cdc16,cdc23和cdc27）由34个氨基酸残基构成，分布广泛，常构成脚手架样结构，介导蛋白质作用，且常形成较大的复合体Tpr结构域丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶是进化上保守的蛋白质结合结构域，参与调节各种真核细胞的发育过程，可凭借SAM结构域为基础形成同二聚体，或异源二聚体Sam结构域Rb结合锌指蛋白是一种介导蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域，已证明它可以与一种类似双重特异磷酸酶蛋白家族作用Set结构域代表蛋白质相关特点结构域可能参与蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物一、酵母双杂交系统l酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。l组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物共转化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达，并且避免蛋白质纯化过程l检测在活细胞内进行，体现真核细胞内真实情况l可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用l可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库l易于转化、便于回收扩增质粒l具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因l酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物“假阳性”：：某些蛋白本身具有激活转录功能l融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能l“假阴性”：不利于核外蛋白研究生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物酵母双杂交的实验流程构建诱饵质粒（X-BD)将质粒转化酵母菌检测X-BD蛋白在酵母中的表达通过酵母生长曲线检测X-BD是否有毒性进行自激活测试生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物酵母筛选阳性克隆子（四缺，x-gal显色反应）共转化再次确认相互作用将阳性克隆子在二缺平板上划线3次提取酵母质粒，转化E.coli，提取质粒PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子DNA测序NCBI数据库搜索生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物:pGBKT7-BD-X构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD00.511.522.533.54051015202530时间(H)OD600AH109IPO13-AH109BD-AH109检测诱饵蛋白是否有毒性123Westernblot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线1.未转化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物（20mM）举例SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade+3-AT（20mM）Gal4-BD+Gal4-ADGal4-BD+Y-ADX-BD+Gal4-AD生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物测序，由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质举例生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。反向双杂交系统生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物、2个融合蛋白必须通过与成分3的结合，间接起到激活报道基因转录的作用，不能直接激活报告基因的转录；b.成分3具有分别与第1、2个融合蛋白结合的区域生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物，SRS36℃36℃membrane生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物半乳糖苷酶,萤火虫和海肾荧光素酶生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物二、细胞内蛋白质共定位绿色荧光罗丹明染色重叠相差生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物三、谷胱苷肽-S-转移酶沉淀试验(GST-pulldown）原理GSTXY谷胱甘肽-琼脂糖球珠细胞裂解物tube4℃下孵育2hGST融合蛋白GSTXY+生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物实验流程（1）Glutathione琼脂糖珠预处理。（2）GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads置于1.5ml离心管中，4℃,摇床孵育过夜。（3）孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。（4）把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.