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O2k简明使用手册一、产品简介及应用：OROBOROSOxygraph-2k是高分辨率的呼吸测定仪。相对于市场上的传统呼吸测定产品，这套系统具有效率高，分辨率高的特别。这款仪器为生物能学，线粒体生理学，线粒体病理的临床诊断和研究树立了一个新的标准。常用于低呼吸活性、快速代谢反应和低氧水平的呼吸测定，如1病理现象导致的呼吸微弱：细胞凋亡、线粒体或新陈代谢疾病、老化、离体再灌注损伤、过氧应激等2活检取样，样品比较少3量比较少的细胞培养4氧化率和抗氧化能力检测（质量控制）5低水平呼吸检测，生理细胞内氧水平或氧活性6失去呼吸能力的突变体二、原理简介：在封闭的容积内，随着样品呼吸的进行，样品内的氧浓度不断减少，进而通过选择性透过膜的氧分子不断减少，根据反应原理式：O2+2H2O+4e—4OH-4Ag-4e—4Ag+由于电解质为KCL溶液因此会形成AgCL沉淀和KOH溶液在电压的作用下，OH-会定向移动，形成电流，从而离子浓度的大小决定电流的强弱，因此氧浓度的大小也就决定了电流的大小，也就决定了输出信号的强弱！三、参考检测样品浓度：检测样品的最小单位SampleConcentrationVolumeTemp.心脏线粒体0.01mgproteincm−32.0cm330oC可透肌纤维1.5mgwetweightcm−31.5cm330oC内皮细胞0.2106cellscm−32.0cm337oCT-淋巴细胞1106cellscm−31.5cm337oC四、主要技术参数：玻璃仓容积：6ml玻璃仓有效体积：1.5-3.5ml温度范围：2-45℃温度稳定性：0.005℃90分钟以后温度变化速率：20-30℃，15分钟；30-20℃，20分钟温度信号分辨率：0.001℃流动氧检测限：0.5pmol/s.ml测试范围：氧气分压0.01-100kpa压力分辨率：0.1kpa搅拌子转速：100-800rpm五、主要部件：主机，抽吸装置，附件包（包含传感器、反应仓、钛金属塞、有机玻璃盖、膜工具、Peek磁力搅拌子、分析软件等六、安装：仓的安装：把仓放入主机内，同时加入磁力搅拌子，旋进传感器控制器，直到仓被悬在空中旋进仓控制器同时回旋传感器控制器，也就是伴随着传感器控制器的后退，仓不断往下移动，当传感器控制器继续后退，仓不能再跟进时，拧紧传感器控制器，这样仓的安装也就结束了！膜的安装：把传感器固定在传感器控制器上，传感器上有序列号，需要与软件对应，因此，不建议交换两个传感器的位置。用膜安装工具，注意：电解质需要加热以去除电解质中的气泡（加热到40度），在装膜之前必须确定电解质中是否有气泡，电解质可以由1.49gKCl加入蒸馏水中形成20ml溶液来配制，取膜要小心，膜的中部绝对不可以被污染，甚至不可以用手碰到，当然边缘部分是可以用手碰到的。装膜的步骤：1先从仪器上取下传感器控制器，连线那一头，直接外拉，传感器那一头，用手握住，然后将图中3的环向掌心压，从而取下传感器。2取下传感器顶部黑色的电极保护胶套，漏出电极膜3利用图中2的电极膜固定器工具，开孔的那一端，夹住电极膜上的固定圈，向外拉，取下固定圈4用摄子取下旧的电极膜，清洗电极液5如图中3，4所示，将图中1的电极膜固定器大头的一端卡在传感器控制器上，注意卡的时候，将图中3的环向下压，才能卡住电极固定器6如图1所示，将电极液加上电极上，并将电极膜水平放置在电极正上方（电极膜要去掉上面的保护纸）6如图中2所示，将电极膜固定圈套在图2所示的电极固定器的顶端7如图3，4所示，将电极固定器小的那部分向下压入电极膜固定器，实现利用固定圈将电极膜固定在电极上的目的。8装上电极保护胶套9将电极插回到传感器插孔上注意：所有的电极插头都需要防静电损伤，建议不要带电拔插电极。七、校准：容积校正：容积校准是为了确定一固定容积，以方便以后实验用，若实验要求不同体积量，需要重新校准。方法：以校正2ml体积为例，往仓内加入2.1ml溶液，（钛金属塞内毛细管体积为0.085ml），将钛金属塞轻轻插入仓中，拧紧固定环的同时，下推钛金属塞。直到钛金属塞内有少量液体溢出，此时的固定环的位置不可再动，而仓内容积也就是2ml，实验时，只要将塞子下推到不能在推动时，实验体积也就是2ml。注意在推进塞子和拧紧固定环时都要慢慢进行。传感器校正：空气浓度：在仓中加入培养液，要求加入培养液体积超过校准后的仓的容积0.1ml，插入钛金属塞，直到钛金属塞上端有少量溢出为止，然后回拔钛金属塞到塞子垫片（Stopper-spacer）正好能插进固定环和钛金属塞子之间的空隙为止，这样就保证在仓内液面上有一段空气的存在，打开软件启动转子，观察图像，平衡过程比较长，但一小时之内应该可以达到稳定状态，此时软件中是蓝线，即氧浓度值应呈一条直线，而红线（氧消耗）则在0左右波动。当信号稳定后，在增益设在2的情况下，氧浓度对应的传感器电极值一般在4左右。利用软件标记功能，选取一段平滑的氧浓度曲线作为Mark1，以备以后两点校准时将Mark1的值作为饱和氧浓度R1之用。注意该培养液中的空气需要处在饱和状态。零氧浓度：零氧校准通常选用线粒体溶液或细胞悬浮液，待溶液中的氧被耗尽时，等到稳定的曲线，此时氧浓度应该接近于零，可以作为两点定标的R0值，R0的实际电压值应该小于3%×R1，但更重要的是要求零氧信号必须稳定。在本系统中，厂家提供有零氧试剂，可以很快速的使氧浓度降低的零点。同样的，使用软件标记功能，选取一段平滑的氧浓度曲线作为Mark2，以备两点定标时作为零氧浓度R0之用。两点校准：选择Oxygraph菜单下选择氧校准，调入R0位置调于Mark2,R1位置调于Mark1，Zenda即可实现两点校准。注意：DatLab软件每次开机，都会自动调用最后一次校正的数据。如果当次实验，没有校正，软件界面中会显示本次未校正的黄色，如果当前实验中进行了校正，则显示绿色。我们建议，每次实验之前，进行R1校正，R0校正的数据可以沿用之前校正数据。八、软件介绍：软件连接和仪器基本设置OroborosO2KC系列以前的仪器使用SerialPort，C系列以后的仪器使用USB接口。软件方面，从DatLab5.0开始支持USB连接。对于新装的仪器，开机后，请选择oxygraph菜单下的connecttoO2Katstart，这样就不用每次开机，设置仪器连接。然后选择O2KControl（快捷键F7），进行仪器端口设置和仪器基本参数设置。仪器控制选项：温度：2-45摄氏度传感器增益：1、2、4、8V/μA，预设值为2当实验环境高出氧溶解度时，选择更低的增益，也就是羔羊浓度时低增益，低氧浓度时高增益，实际情况根据左下端现实的电压值来定，电压值大于或接近10V时必须选择更小的增益。极化电压：该预设值为800mV，范围在-2000-2000mv，基本不用改动，任何变动都须重新校正。但在对硫化氢不敏感的高硫浓度是严重，需要更换相应的电解质，同时极化电压从0.8v下降至0.1v。搅拌子转速：预设值为750rpm在低转速阶段，信号的水平和稳定度随着速度的增加而增加，但是太高的转速会带来较大的噪音。同时，两仓的转速最好选择相同的转速，以减少相互电子干扰。数据记录间隔：设置范围：0.2-10s，一般两个仓设置相同，对大多数实验而言，2s是一个最佳值，在低记录间隔时，通量的噪音增加，在线信号强度都会降低。如果选择了一个比较小的记录间隔，最好也选一个较小的通量推导因子来补偿。点击connecttooxygraph-2K之后，系统将自动将设置参数传递给仪器，并要求确认数据保存的文件名，并正式开始实验。传感器设置：此面板用于输入传感器编号实验设置：仪器基本设置确认后，仪器就开始自动记录氧浓度和氧消耗，此时可以通过F3快捷键或experiment菜单下的edit进入实验设置所有编辑可以在实验中随时进行，而其后的数据分析会在编辑后信息的基础上进行。样品：样品名称，其中Medium代表没加样品一般在校准时用单位：用来表达样品浓度或总量MillioncellsmgUnits：单位，呼吸参考通量背景校正：以背景样通量和氧浓度的线性相关性为基础，分为截距和斜率，缺省值a-2.00,b0.025,一般情况下这两个值不用修改。在slopeuncorrected模式下，背景校正不起作用。在进行传感器校正时，一般都是在slopeuncorrected模式下。通量推导因子（FluxderivationN)：进行积分计算氧耗量所采取的点的个数，可以设成5－40.N越小，时间分辨率越好，N越大，氧耗量曲线越光滑。信号栏、状态栏：O2k：Panauto表示硬件与软件已经连接，并且软件在实时记录参数O2k：Panoff软件与硬件连接，自动记录已经关闭，图上显示的静止状态Zoom，Mark：通常在浓度上做标记是为了校准，而在通量上做标记是为了导出平均值并进行分析右下角选项：图表显示类型，选择不同的类型，屏幕上就会显示不同图表数或纵坐标含义。Saveanddisconnect:当断开连接后不再记录数据但加热元件、转子等继续工作Time:显示开机运行的时间，以秒为单位O2（A）V：A仓的氧电极电压值Temp:当单仓内温度Barom.Pressure:大气压力，KPa为单位PeltierPower:当前温控系统的输出功率百分比pX(A)V:A仓pX传感器的电压值AmpV:自由基电极或信号信号值（电流信号转换为电压信号之后的）菜单详细介绍：（1）File菜单Open打开之前的数据文件Close关闭数据文件，可以选择保存或不保证设置Save按新的设置保存数据文件，覆盖原有文件Saveas以新的文件名保存文件FileSearch查收数据文件Delete删除当前打开的文件Import输入软件设置模板Export输出数据成其它格式Exit退出软件（2）Experiment：实验菜单Edit编辑实验Protocol查看实验设置Event：在某个时间点的行为记录，一般用1-10个字母命名，同时也可以进行适当描述，设置事件可以用快捷键F4EventTable事件列表（3）Plots—FluxControlRatios：流量控制比j=（Jt-J0）/(J1-J0)其中Jt是t时的流量，J0为定义最小流量，J1为选择的最大流量，即将流量进行两点定标，最大流量为1，最小流量为0,这样j(当前流量）就处于0-1之间的值，根据j的大小来评价流量。（4）Calcuate现版软件中该功能未开放。（5）Marks：标记Statistics标记状态统计Names标记名称管理，可通过模板修改ManagerTemplates管理模板常用Mark名称：Routine:正常的未破膜呼吸状态Leak:加了寡霉素之后，线粒体呼吸抑制状态ETS：解耦合后线粒体电子传递系统能力ROX：ETS抑制后剩余的氧消耗（6）Graph：显示图表设置Add添加一个表格到最下方DeleteBottomGraph：最下层的图表被删除，但可以用Add恢复GraphLayout-SelectPlots：设置每个图表上显示的内容，比例尺等MouseControl:ZoomMark鼠标功能可以在放大和标记之间切换PeltierPower，用来控制铜板温度，用最大功率的百分比来表示(7)layout图标输出模式01CalibrationExp.Gr3-Temp用于氧浓度校正过程，一共三个图，图1和图2分别显示仓A和仓B的氧浓度和氧消耗，图3显示温度和温控的功率输出。其中图1和图2的Y2值显示没有经过背景校正的氧消耗。02BackgroundExperiment用于背景氧测试只有两个图，分别对应仓A和仓B，Y2显示氧消耗，开放状态下，Y2处理零表明氧电极的稳定性。密闭状态下，Y2值代表氧电极本身的氧消耗以及仓材料溶氧和释放氧。03BackgroundExp.Corrected显示背景校正之后的氧浓度和氧消耗在记录了背景氧消耗并将背景校正的参数输出到了ExperientEdit菜单之后，就可以选择这个格式进行显示。在这个状态下，氧消耗