生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成

第十三章DNA的生物合成DNA的生物合成•复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。•反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。•修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。•DNA的重组与克隆细胞、个体及物种的遗传特性要在代代相传中得到维持，有赖于遗传物质的完整、准确的复制并分配至子代细胞。现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。13.1DNA的复制•亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA分子的过程•DNA复制过程的研究一般采用三类系统ΦX174DNA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的DNA复制13.1.1DNA的半保留复制•即新的双链DNA中，一股链来自模板，一股链为新合成的•复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性•1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制13.1.2DNA复制的起点和方向•基因组能独立进行复制的单位称为复制子，每个复制子都含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点•大多数原核生物染色体DNA的复制是双向，形成复制眼，单向复制的特殊形式，称为滚动环式•真核生物染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。DNA复制的特点与条件（1）半保留复制（2）有一定的复制起始点（3）需要引物（4）双向复制（5）半不连续复制（6）复制方向5´→3´A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点（termination,，ter）oriterABC13.2原核生物DNA的复制•原料：dNTP，Mg2+，双链DNA模板•引物：小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的3´-OH。•引物酶：用于合成复制所必需的RNA引物•解螺旋酶：DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。•单链结合蛋白：稳定已经解开成两股的DNA单链。•拓扑异构酶：解DNA分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。•DNA连接酶：连接DNA双链中的单链缺口•DNA聚合酶：复制酶，兼有校读、纠错13.2.1参与原核DNA复制的酶和蛋白质（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolIII不同种类亚基数目1≥7≥10每个细胞的分子数40020生物学活性10.05155´→3´聚合酶活性＋＋＋3´→5´外切酶活性＋＋＋5´→3´外切酶活性＋－－聚合速度（核苷酸/S）16~2040250~1000连续合成能力（核苷酸）3~2001500≥5000功能校正，去除RNA引物应急修复主要酶（A）5´→3´聚合酶催化磷酸二酯键生成，延长子链（B）3´→5´外切酶切除子链3’端一个错配的碱基，即时校读（C）5´→3´外切酶切除子链5’端一段序列，包括引物和突变的片段①DNA聚合酶Ⅰ:单体酶，多肽链内含一个锌离子，多功能酶，用于切除引物RNA，并填补留下的空隙53聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；35外切酶活性（对双链无作用，校对功能；但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）53外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）在DNA链的3形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。酶催化新加入的脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3´-OH共价结合，并从新加入的脱氧核苷三磷酸分子上释放焦磷酸，因此合成的方向是从5´端到3´端。所产生的焦磷酸随即被细胞中的焦磷酸酶分解产生无机磷酸，推动聚合反应的完成Klenow片段，含DNA聚合酶和3´→5´核酸外切酶活性②DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3´5´外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。③DNA聚合酶Ⅲ：原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。具有5´3´DNA聚合酶活性（亚基，速率高）；具有3´5´外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；具有53外切酶活性（单链有效，其意义未知）。④DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。β-滑动夹子将正在复制的DNA固定在夹子中心，并能随DNA复制沿着模板DNA链滑动使DNA聚合酶不易从模板脱离，有利于DNA的连续复制（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质①引物合成酶（引发酶）此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。②DNA连接酶若双链DNA中一条链有切口，一端是3´-OH，另一端是5´-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。连接酶的反应机制酶+NAD+（ATP）↔酶-AMP+烟酰胺单核苷酸（PPi）酶-AMP+P-5´-DNA↔酶+AMP-P-5´-DNADNA-3´-OH+AMP-P-5´-DNA↔DNA-3´-O-P-5´-DNA+AMPDNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用③拓扑异构酶催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。连环数：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋旋绕另一条链缠绕的次数。108局部解链后改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链④解螺旋酶（解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。rep蛋白沿3´→5´移动，而解螺旋酶I、II、III沿5´→3´移动。⑤其它蛋白因子单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）引发前体单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。引发前体它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n´、n´´和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5´3´方向移动，具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，n´蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。冈崎片段在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成5´3´的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。13.2.2大肠杆菌DNA复制的起始•大肠杆菌的复制的起始点称OriC由DnaB（解螺旋酶）在DnaA和DnaC协助下解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。DnaA辨认结合于AT区，AT区DNA解链。DnaB在DnaC协同下，结合于解链区，沿5´→3´移动，解开DNA双链，SSBP参与，形成复制叉。复制叉的结构及参与复制的酶与因子13.2.3大肠杆菌DNA链的延长•这个过程由DNA聚合酶III催化，它是主要的复制酶。前导链：为连续合成，合成方向与解链方向一致，它的模板DNA链是5´→3´链。后随链：不连续合成，在RNA引物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与解链方向相反，它的模板DNA链是3´→5´链。复制时，从一个固定的起点（origin）开始复制，此时双链DNA解开形成两条单链，分别作为模板进行复制，由此形成的结构很像叉子，被形象地称作复制叉（replicationfork）随从链的合成领头链的合成13.2.4大肠杆菌DNA复制的终止•由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来•当一个复制叉先期到达终止区时，其复制会停止，待另一个复制叉到达同一位置，两个复制叉相遇，即完成了整个DNA的复制过程13.3真核生物DNA的复制•真核生物DNA复制的基本过程与原核生物相似，但参与复制的酶和蛋白质与原核生物不同，复制起始的调控更加复杂。13.3.1参与真核DNA复制的酶和蛋白质•真核生物DNA聚合酶主要有5种•α（Ⅰ），β（Ⅳ），γ（M），δ（Ⅲ），ε（Ⅱ）真核生物DNA聚合酶的酶促反应与原核生物DNA聚合酶相似，均以4种dNTP为底物，需要Mg2+激活，要求有模板和引物，链的延伸方向为5´→3´，也按半不连续的机制分别合成前导链和后随链DNA聚合酶的类型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相对分子质量/103100~2204560122亚基数4123~54聚合酶活性5´→3´＋＋＋＋＋外切（校正）酶活性3´→5´－－＋＋＋引物（合成）酶活性＋－－－－持续合成能力中高高有PCNA时高高对抑制剂敏感蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素细胞定位核核线粒体核核13.3.2真核生物DNA复制的起始•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。复制的起始真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与，还需拓扑酶和复制因子（replicationfactor，RF）。增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen,PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。复制的延长复制的终止染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（1）SV40DNA的复制①2分子由SV40基因组编码的T抗原六聚体作为起始蛋白（相当于E．coli的DnaB蛋白），在ATP的存在下与SV40复制起始区结合，使起始区的DNA解链。②复制蛋白A（replicationproteinA，RPA）作为SSB与单链区结合，进一步提高T抗原的解旋酶活性，致使解链区不断扩大，但真核生物的RPA与单链DNA结合没有协同效应。③DNApolα-引物酶复合物与T抗原/RPA复合物结合，合成前导链约10nt的RNA引物，和约30nt的DNA。④复制因子(replicationfactor，RFC)先与新合成的DNA3´端结合，随后PCNA取代polα-引物酶结合到DNA模板上，前导链的合成暂时中断。⑤polδ结合到PCNA-RFC复合物上，由于polδ具有校对能力，PCNA与模板DNA结合牢固，该复