五分类血细胞分析仪的原理及使用

五分类血液分析仪原理及使用HematologicAnalyzers血液分析仪,临床血液一般检查最常用仪器。50年代，美国库尔特（W.H.Coulter）发明电子血细胞计数仪并申请专利。1982年，Technicon公司生产了H6000型血液细胞，分析仪器，应该是首款具有白细胞五分类能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪HITACHI8200型，仅仅是用于完成白细胞血片分类的仪器，没有其他血细胞计数分析能力。血液分析仪优势检测项目多速度快精度高易操作•血液细胞分析仪是医院检验科、化验室的常规设备之一，也是发展最快、应用最普及的检验仪器，当前血液细胞分析仪分为三分群和五分类两种。国际市场上五分类血液细胞分析仪已经成为发达国家医院血液临床检验的主流产品，但由于五分类血液细胞分析仪需集光学、电子、气路、液路、计算机等技术于一体，技术含量非常高，纵观全球，也仅有美国、法国、日本等国家的6个厂家能够生产真正意义上的五分类血液细胞分析仪。•2006年4月深圳迈瑞BC-5500推出之前，由于国内没有掌握该类产品生产制造的核心技术，因而在中国市场销售的该类产品由国外品牌所垄断，价格都比较昂贵，导致该类产品不能在中国医院临床检验中大范围推广应用，BC-5500的推出推动了五分类血液细胞分析仪在国内的临床应用，提高整个国内血液细胞检测的临床应用水平。一、常见血细胞分析仪品牌•1、库尔特•2、希思美康•3、迈瑞•4、雅培•5、光电•6、拜耳•7、……二、五分类血细胞分析仪的检测原理（一）、仪器基本结构1、机械系统2、电学系统3、光学系统（二）、分类计数的基本原理•1、电阻抗的利用•2、激光技术、射频技术、组织化学技术的应用•血细胞五分类技术是一种综合应用光学、机械学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、免疫学等学科技术，让被测溶液流经测量区域并逐一检测其中每一个细胞的物理和化学特性从而对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定和分析的方法。它一秒钟能分析几千个细胞，并同时测定细胞的多个参数。阻抗法也在五分类血细胞仪中被采用，即所谓的鞘流阻抗法。1、电阻抗原理，又称库尔特原理孔电流真空内电极外电极-+血细胞悬液标本杯鞘流技术联合电阻抗的应用2、激光技术、射频技术、组织化学技术的应用五分类仪器与三分类仪器的主要区别在于：白细胞不再粗略地以大小来进行分群，而是采用激光技术、组织化学技术、射频技术等等来对白细胞进行分类。根据仪器厂家的不同，不同品牌的仪器采用了不同的分类计数。•在激光技术中目前有半导体激光和气体激光。半导体激光功率弱,但作为细胞分类自己足够;气体激光功率强。二者比较半导体激光具有寿命长(7~10年)体积小,启动快,耗电小,对稳压要求低,更为经济适用等特点。•（1）电阻抗、高频电导及激光散射联合检测法•即库尔特公司的VCS技术。•V:代表体积容量。电阻法微孔技术应用于计数血细胞和测定其体积的大小。•C:代表传导性即电导(conductivity),指一束电磁波或称射频,穿透细胞的传导性,它取决于细胞的大小和内部结构;经校正后的传导性叫opacity即“不透明性”,这时不再反映细胞大小,而是反映细胞内部的结构,像核的大小,核浆比例和密度等。•S:代表散射(scatter),指在不同角度测得的散射光强度。由于各类细胞的表面结构不同和颗粒大小不同而对光的散射各异,进而区分各类细胞。容量、电导、光散射（volume，conductivity，scatter,VCS）法原理细胞体积技术（测量细胞大小）电导性技术（测量细胞内部结构）光散射技术（测量细胞形态、细胞核和细胞颗粒）。体积电导光散射VCS可显示3种细胞散点图DF1（体积值和散射光值）DF2（体积值和电导值）DF3（体积值和电导值）•仪器在单一通道上同时用这三种方法对同一白细胞进行测量,避免了有些血液分析仪要设计好几个通道或加染色试剂的麻烦。•采用VCS技术的仪器主要是Coulter公司的STKS型、MAXM型以及Gen.s型五分类血液分析仪。MAXM型和Gen.s型可计数网织红细胞,Gen.s型可选配自动制血片机。以上几种型号还可直接计数CD4和CD8淋巴细胞,并算出其比率。（2）光散射和细胞化学染色联合应用•Bayer公司的的DVIA120型和2120型血细胞分析仪、Sysmex公司的SF-3000型、迈瑞的BC-5500血细胞分析仪均采用了该原理进行工作。•利用激光散射和过氧化物酶染色技术进行细胞分类。利用光散射的原理计数血细胞,因细胞表面结构不同,在不同角度上散射光有差别,有助于对白细胞的区分。•白细胞化学染色•在稀释液中加入过氧化酶(MPO)的底物及显色剂,根据白细胞对MPO的反应分类。中性细胞MPO为强阳性,嗜酸性细胞阳性更强,单核细胞为弱阳性,淋巴细胞阴性,嗜碱性细胞亦为阴性,故综合光散射和细胞化学染色的特点,可得到二维或三维图像-----不同颜色的散点图。由于嗜碱性细胞不含此酶,不能被检测,因此一些仪器专门设置了嗜碱性细胞检测系统,它的测量通道采用时间差的方法,与RBC、PLT的测量系统共用一个通道。（3）电阻抗和射频电导联合检测法•这种方法是分别采用四个检测系统来检测不同类型的细胞•①淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞检测系统:在细胞悬浮液中加入溶血剂使红细胞溶解,而使白细胞保持完整细胞浆及核形态近似于生理状态,当这些细胞通过检测系统时,对白细胞进行电阻抗法(测量细胞体积)和射频电导法(检测细胞核和颗粒密度)的联合检测,结果将细胞分成淋巴细胞、单核细和中性粒细胞三个群体。•②嗜酸性细胞和嗜碱性细胞两种检测系统:在细胞悬浮液中加入特殊的溶血剂,除嗜酸性细胞和嗜碱性细胞外,其他细胞均被溶解或萎缩再对保持完整的嗜酸性细胞或嗜碱性细胞进行计数。•③幼稚细胞检测系统:在细胞悬浮液中加入硫化氨基酸,由于占位不同,结合在幼稚细胞的氨基酸比成熟细胞多,且对溶血剂有抵抗作用,当加入溶血剂时,成熟细胞被溶解,只保留着可能存在的幼稚细胞用来计数。Sysmex公司的SE-9000血细胞分析仪就是采用这种方法进行五分类的。电阻抗与射频法能透入细胞内，测量核的大小及颗粒的多少。RF:射频电流细胞内部结构信息DC:直流电细胞大小的信息（4）多角度激光偏振光散射检测法•仪器使用鞘流液将标本血稀释,稀释后白细胞的内部结构近似于自然状态,只有嗜碱性细胞由于其吸湿的特性而使细胞结构有轻微改变。红细胞内的血红蛋白在高渗透压的作用下,从细胞中分离出来。而鞘流的水分则进入红细胞内,使细胞膜结构仍然完整,它与鞘流的折光系数相同,不影响白细胞的检测。仪器同时从四个角度来检测通过激光束的细胞所产生的散射光,因为细胞大小、折射指数、核形、核浆比率以及颗粒性质等,均可影响在不同角度测得的散射光量。0°：前角光散射（1°～3°），可粗略测定细胞大小。10°：狭角光散射（7°～11°），可测定细胞内部结构相对特征。90°：垂直光散射（70°～110°），测定细胞核分叶情况。90°：消偏振光散射（70°～110°），区分嗜酸性粒细胞与其他细胞。•值得一提的是市面上偶见假五分类血球仪。假五分类血球仪则不用上述原理分析血细胞成分,更多的使用电脑软件的分析而得出五分类结果。分辨是否真五分类技术的血球仪，如果是试剂法,试剂不应该少于四种,如果是激光法,试剂不少于三种。三、五分类血细胞分析仪的使用•1、自动进样•2、手工进样•3、末梢血、静脉血的可选性•4、结果的判断•5、质量控制•6、仪器的校准准品的来源、什么情况下需要校准？如何校准？•7、仪器的维护标本的重要性•1、高档的仪器并不意味着结果一定可靠。•2、标本的采集直接关系到结果的准确性。•压脉带的使用时间、抗凝剂的影响、真空管的使用、血量的控制、标本放置的温度和时间、标本的混匀等等。检验报告的审核•1、当日质控是否在控。•2、比较报告各参数之间是否有矛盾。•3、注意观察多个测定标本相关参数是否有一致的系统误差。•4、报告与临床是否符合，不符合时可能存在的原因。如PLT过低、过高。•5、什么样的结果必须手工复查？如何复查？复查完毕后的报告签发模式。•6、直方图、散点图的利用。血细胞自动分析异常结果人工显微镜复检•1、镜检复核的现状•血细胞分析仪仍只能作为CBC分析的一种过筛手段，当遇到可疑情况，尤其是在病理条件下，其测定结果并不可靠，需要人工以显微镜复查，这已是不争的事实。但是，国内目前各医院检验科对CBC异常结果基不或很少进行人工显微镜复查，这种现象在经济发达的沿海地区更是普遍。有资料显示，国内各医院CBC实际镜检率在0%～15%，大部分医院镜检率5%或者不镜检。这种现象引发了不少的医疗投诉、纠纷或事故。分析这类题出现的原因可能有:(1)认识不够，认为血细胞分析仪尤其是五分群的血细胞分析仪的检测结果可靠，不需要复查；(2)工作量大；(3)怕麻烦，图省事；(4)目前没有一个可参照的执行标准，即对CBC结果的人工复查的标准、内容、方法及程序尚无明确的规定。•需要镜检的标准•目前即使是最先进的血细胞分析仪也不能完全取代人工镜下白细胞分类。因此，各实验室应根据所使用的仪器型号、性能和实验室条件，制定出手工复检方案，建立涂片复检制度。只有在WBC、Hb、Plt均在正常范围内，细胞散点图和直方图均正常，仪器无报警显示情况下，仪器分类结果才可作为筛选数据报告。•通过镜检达到的目的•通过显微镜检查，核实仪器出现的各类报警是否真实存在，有无原始及幼稚细胞，有无血细胞形态异常，有无小红细胞、红细胞碎片、微小血凝块、巨大血小板、血小板聚集等，并估计白细胞、血小板数量，必要时对结果进行校正后才能发出报告（如有核红细胞存在时对白细胞计数进行校正）。•血细胞自动分析与临床的紧密结合•CBC检测结果最终是用于临床患者的诊断、治疗、预后监测或用于受检者的健康状况的评估。因此，当遇检测结果异常时，一方面可咨询受检者当事人/亲属或通过实验室信息系统(LIS)查受检者检测记录外；另一方面与临床联系非常重要，因为临床医生更加了解受检者/患者的病情与实际情况，通过与临床的联系，可了解并证实异常CBC结果与患者病情的符合程度或因其他原因如输液或患者标本张冠李戴引起的CBC结果异常。总之，与临床联系可起到事半功倍的效果。1、血细胞直方图横坐标为血细胞体积大小纵坐标为不同体积细胞的相对频率。结果的判断白细胞直方图%3590160300400450(fl)红细胞直方图100200300400(fl)%血小板直方图直方图在2～28fl（不同仪器不一）。102030(fl)%散点图1、白细胞直方图正常白细胞直方图异常白细胞直方图2、红细胞直方图（1）正常红细胞分布：50～200fl（2）异常红细胞直方图3、血小板直方图正常血小板直方图呈左偏态分布：2～30fl分布，主要在2～15fl。异常血小板直方图血液分析仪江苏大学基础医学与医学技术学院朱伟血细胞分析仪教学要求•掌握血细胞分析仪的概念、库尔特原理、仪器的基本结构。•熟悉联合检测型血细胞分析仪器的检测原理，网织红细胞检测原理，血红蛋白检测原理、仪器性能评价和维护。•了解血细胞分析仪的分类、性能指标、常见故障和排除及进展。一、血细胞分析仪概述血细胞分析仪(Bloodcellanalyzer,BCA)是指对一定体积全血内血细胞异质性进行自动分析的临床检验常规仪器。又称血细胞自动计数仪(ABCC)、血液学自动分析仪(AHA)。ABCC代表早期的低档次BCA，AHA外延过大。发展史手工计数仪器简单计数两分群三分群五分群五分群＋网织红•20世纪40年代末，电阻抗法微粒子计数专利•50年代，CoulterModelA型用于临床•60年代，测定参数达7项•70年代，全血细胞计数（CBC）•80年代，双通道、白细胞2~3分群、五分群•90年代以来，多功能、多参数、流水线血细胞计数仪（Bloodcellcounter)Coulterprinciple：微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化，并根据这种电阻变化特点将其应用于微小粒子的粒度测量和计数上。1953年获得美