鹅掌楸碱银配合物体外诱导肺癌SPC-A-1细胞株凋亡及其机制的研究

细胞株凋亡及其机制的研究刘华钢，秦三海，王博龙，杨斌，刘丽敏广西医科大学药理教研室，广西南宁（530021）E-mail：[e-mail]摘要：目的：探讨鹅掌楸碱银配合物体外诱导肺癌SPC-A-1细胞株凋亡作用及其机制。方法：应用MTT法检测细胞的增殖活性，采用DNAladder检测、细胞形态学观察、酶联免疫法进行凋亡检测；采用RT-PCR检测细胞bcl-2、baxmRNA表达水平，免疫细胞化学法考察细胞bcl-2、bax蛋白的改变，流式细胞术检测细胞内一氧化氮浓度。结果：鹅掌楸碱银配合物对肺癌SPC-A-1株IC50为3.447±0.436µg•mL-1。在鹅掌楸碱银配合物的作用下，癌株出现典型的凋亡特征，琼脂糖电泳出现典型的DNA梯带，细胞形态学表现出细胞核裂解、染色质聚集、核碎裂，胞浆浓缩、有空泡形成，对样本进行Caspase-3活性检测后发现药物作用后细胞中Caspase-3含量明显高于对照组；用药组细胞较对照细胞bcl-2mRNA、蛋白表达降低，同时baxmRNA、蛋白表达升高；用药组细胞较对照细胞内NO浓度升高。结论：鹅掌楸碱银配合物有促进肺癌SPC-A-1细胞株凋亡的作用，其机制可能是改变bax/bcl-2的比值，改变凋亡的调定点，使得凋亡力量在细胞内占主导优势，同时诱导细胞内产生高浓度NO以增加对瘤细胞的杀伤作用。关键词：鹅掌楸碱银配合物；肺癌；凋亡中图分类号：R282171；R28411；R329121；R329125；R73412；R739186鹅掌楸碱银配合物（AgLA2）是以中药两面针提取物鹅掌楸碱为母体，运用配位化学的原理与Ag＋合成的金属配合物，分子式为C34H18N3O9Ag，分子量为720，结构式如下：NOOOAgINOOO+NO3.－本实验中，我们对鹅掌楸碱银配合物体外诱导肺癌SPC-A-1细胞株凋亡作用及其机制进行了研究。1.材料与方法1.1材料1.细胞株：人肺癌SPC-A-1株购自上海肿瘤研究所，5%CO2，37℃恒温条件下培养。2.主要试剂：鹅掌楸碱银配合物为广西师范大学配位位合成；细胞凋亡-DNAladder抽提试剂盒、NO荧光探针购自江苏碧云天生物技术研究所；humanCaspase-3InstantELISA购自Bender公司；MTT购自Amresco公司；RPMI1640购自GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；TrizolReagent购自Invitrogen公司；RevertAidTMFirstStrangcDNASynthesisKit购自MBI公司；PCRReagent购自大连TaRaKa公司；二步法免疫组化检测试剂、鼠抭人bcl-2、bax蛋白单克隆抗体、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。3.主要仪器：二氧化碳培养箱为ThermoForma公司产品，雷勃MK3酶标仪为ThermoLabsystems公司产品，Geldoc2000凝胶成像分析仪为美国Bio-Rad公司产品,日本)透视电镜，EpicsXL型流式细胞仪为美国Coulter公司产品。1.2方法1.2.1T法检测细胞的增殖活性、鹅掌楸碱银配合物IC50值的测定采用MTT法，每组设6个复孔，药物细胞终浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25µg•mL-1，DMSO细胞终浓度为1%，细胞加药培养48h，OD值测量波长为双波长570nm/630nm，以下列公式计算抑制率：抑制率=（空白组OD值一实验组OD值）/空白组OD值×100%1.2.2凋亡检测1药物诱导细胞凋亡：检测前对细胞进行了预处理：取处于对数生长期的细胞株，胰酶消化后，将细胞浓度调整为1x106•mL-1，加入药物使细胞药物终浓度为5µg•mL-1并做空白对照，作用12h后，收集细胞进行下一步的实验研究。每种细胞株不同批次重复3次。2DNAladder检测：细胞的预处理同2、2、1，药物作用时间分别为12，24,36,48h，采用DNAladder试剂盒提取DNA并经1.5%琼脂糖凝胶电泳，50v，lh，凝胶成像仪下观察结果。3形态学观察：预处理后的细胞，经戊二醛固定后，按常规电镜包埋步骤处理，透视电镜下观察对比用药前后细胞形态变化并拍照。4Caspase-3活性的检测：预处理后的细胞，每瓶加入0.5mL溶解缓冲液，室温下置于摇床上100rpm震摇1h，以5000r·min-1离心后收集上清。采用Caspase-3ELISA试剂盒，按说明书操作。由标准孔对其光密度值(OD值)进行回归分析，得出标准曲线，并由标准曲线回归求得相应样品孔中Caspase-3浓度。1.2.3凋亡机制检测1RT-PCR检测bcl-2及bax基因mRNA表达水平：预处理后的细胞，经Trizol提取细胞总RNA，在260/280nm测定其浓度和纯度后并电泳检测完整性，经逆转录成cDNA。按操作说明进行PCR反应，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min,bcl-2基因65℃、bax基因60℃退火45s;72℃延伸2min,共反应30个循环,昀后一个循环后72℃延伸7min。PCR扩增所用引物序列如下：bcl-2:上游：CGACTTC-GCCGAGATGTCCAGCCAG,下游:ACTT-GTGGCCCAGATAGGCACCCAG，片段389bp；bax:上游：ACCAAGAAGCTGAG-CGAGTGTC，下游：ACAAAGATGGTC-ACGGTCTGCG，片段365bp；β-actin：上游CGGAACCGCTCATTGCC,下游：AC-CCACACTGTGGCCCATCTA，片段289bp。PCR产物各10µL，在含有0.5µg•mL-1溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中以100V稳压电泳45min,完毕后凝胶置于凝胶电泳成像分析仪上观察分析结果。2免疫细胞化学法分析bcl-2及bax蛋白表达水平：在六孔板中加入预先经多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片，按1x105•mL-1浓度种板，12h后取出爬片，采用二步法免疫组化，用PBS代替一抭作阴性对照。bcl-2蛋白阳性反应为胞膜或胞浆染成棕黄色，bax蛋白阳性反应为胞浆染成棕黄色，染色结果采用半定量分析[1]：按阳性细胞占总细胞数的百分率分为4级，I级：5-25%；II级：26-50%；Ⅲ级:51-75%；Ⅳ级：75%；≥5%作为阳性标准。各阳性对照片的染色强度定为4级作为参照，按阳性细胞的染色强度分为4级，1级：(±)；2级：(+)；3级：(++)；4级：(+++)。在全片上、下、左、右、中各随机选取5个视野，观察每个视野中阳性细胞的染色强度及该强度细胞占视野中所有细胞的百分率。一个视野的IHC染色得分＝该视野中的各种染色强度与该强度阳性细胞的百分率级别的乘积之和，组织的IHC染色综合得分＝5个视野的IHC染色得分之和/5。3流式细胞术检测细胞内一氧化氮（NO）浓度：收集预处理后的细胞，用稀释好的NO荧光探针重悬细胞，37℃孵育20分钟后，PBS洗涤三次，采用488nm激发波长，525nm发射波长（检测FITC的参数设置），以对照组调零进行细胞内NO浓度的检测。1.2.4统计学处理所有实验数据以x±ｓ表示。显著性水平为(P0.05)，组间比较选用t检验，率的显著性检验选用x2检验，采用SPSS软件分析。2.结果2.1鹅掌楸碱银配合物IC50值细胞每个浓度梯度的抑制率得出后，采用Bliss法求得鹅掌楸碱银配合物对肺癌SPC-A-1株的IC50为3.447±0.436µg•mL-1。2.2凋亡检测结果1.DNAladder电泳结果：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50～300kbp长的DNA大片段,或180～200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。本实验细胞药物作用后出现典型的DNAladder现象，如图1M：昀小片断为100bp的Marker,1：对照组，2：药物作用12h，3：药物作用12h，4：药物作用36h，5：药物作用48h后的电泳图谱图1肺癌SPC-A-1株DNAladder图谱2.形态学改变：透射电镜下，对照组细胞核仁明显，核膜清淅，核浆比正常，细胞器丰富，表面有微绒毛突起。用药组细胞体积变小，胞浆空泡增多，核染色质固缩,边集，表面微绒毛消失，常呈新月形,，出现典型的凋亡小体，如图2。左：正常组，右：给药组图2细胞透射电镜图3.Caspase-3活性的改变：测得OD值后，根据OD值由标准曲线回归求得相应样品孔中Caspase-3浓度，药物作用后细胞中Caspase-3浓度为1.82士0.22ng•mL-1，对照组细胞中浓度为1.21士0.07ng•mL-1，差别有显著统计学意义(P0.05)。2.3凋亡机制检测结果1.bcl-2、baxmRNA表达检测结果：经内参β-actin标准化后，用药组细胞的bcl-2mRNA的表达水平较对照组降低，而baxmRNA的表达水平较对照组升高，结果见表1，图3。表1目的基因mRNA的相对含量(x±s)组别比值对照组药物组P值bcl-2/β-actin1.281±0.0340.491±0.032＜0.05bax/β-actin0.501±0.0441.183±0.052＜0.05M：Marker，1、2、3：对照组，4、5、6：给药组，左：bcl-2，产物389bp，右：bax,产物365bp，β-actin产物289bp图3：bcl-2，baxRT-PCR产物凝胶电流图2.bcl-2、bax蛋白表达检测结果：经统计分析，用药组细胞bcl-2蛋白IHC染色综合得分较对照组低；bax蛋白IHC染色综合得分较对照组高，结果表2，图4,5左：阴性对照组；中：正常对照组；右：给药组图4bcl-2蛋白表达检测结果左：阴性对照组；中：正常对照组；右：给药组图5bax蛋白表达检测结果表2免疫细胞化学染色综合评分组别蛋白对照组药物组P值bcl-210.81±0.346.91±0.32＜0.05bax10.07±0.4516.44±0.51＜0.053.细胞内一氧化氮浓度检测结果：用药组细胞内一氧化氮平均阳性率为1.12士0.04，对照组细胞一氧化氮平均阳性率为0.78士0.02，差别有显著统计学意义(P＜0.05)，如图6。左：正常组，右：给药组图6正常组细胞流式图讨论根据抗肿瘤药物疗效的评价标准之一[2]，即体外抑瘤试验：合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC50＜10µg•mL-1或植物粗提物的IC50＜20µg•mL-1，并有细胞毒性的剂量依赖关系，且昀高抑制效率应达80%以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。本实验采用Bliss法求得鹅掌楸碱银配合物对肺癌SPC-A-1株的IC50为3.447±0.436µg•mL-1，小于10µg•mL-1，且昀高抑制效率均超过80%，故由此可判断鹅掌楸碱银配合物体外对肺癌SPC-A-1株有杀伤作用。DNAladder检测发现癌株药物作用12，24,36,48h后，均出现典型的凋亡标志DNAladder，据此可判断鹅掌楸碱银配合物体外对癌株有促进凋亡的作用。透射电镜下的凋亡细胞昀具特征性，也是判断细胞凋亡的标准，本实验中细胞药物作用后细胞皱缩、破碎、胞浆空泡增多，胞质浓缩，出现典型的凋亡特征，与对照组细胞明显不同，据此可判断鹅掌楸碱银配合物体外对癌株有促进凋亡的作用。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用[3，4]，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功