实验九：鸡胚成纤维细胞的制备

实验九鸡胚成纤维细胞的制备一、实验目的学习和掌握鸡胚成纤维细胞的制备和培养方法；了解原代细胞培养的原理和方法。二、试验器具、试剂、仪器超净工作台，检卵灯，灭菌的细胞培养瓶、眼科剪、眼科镊、平皿、吸管、离心管等；9-11日龄鸡胚；Hanks液，0.25%胰酶消化液，双抗（10000IU/ml青链霉素），7.5%NaHCO3溶液，DMEM营养液，75%酒精棉。三、实验原理病毒能在易感的组织或单层细胞内增殖，并可产生细胞病变，因此，细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疫苗生产和病毒性疾病诊断必不可少的工具。原代细胞培养是体外制备细胞培养物的必经过程，从供体体内取出组织分散成单个细胞接种于培养液中为初次培养，从初次培养到第一次传代培养为原代培养。本实验以鸡胚成纤维细胞作为原代细胞，通过细胞培养实践操作，认识和体会原代细胞的制备方法和影响细胞培养的主要因素，并掌握原代细胞培养的方法。四、实验步骤（一）操作前的准备1、预热培养液：把已经配制好的生长液、Hanks液和胰蛋白酶液放入37℃水浴锅内预热；2、用75%酒精棉擦拭双手和紫外线照射过的超净工作台；3、正确摆放要使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染；4、点燃酒精灯.（二）鸡胚成纤维细胞的制备1、鸡胚的处理（1）蛋壳消毒取9-11日龄的鸡胚，用检卵灯选取血管清楚、活动正常的鸡胚，置蛋架上，令气室端向上，75%酒精棉消毒蛋壳气室部位。（2）胚体采集以镊子击破卵壳气室部位，并除去该部位卵壳。用无菌的眼科镊子撕开蛋壳气室膜并小心拨开绒毛尿囊膜和羊膜，钩住鸡胚头部，移入灭菌的平皿内。用剪刀剪去胚头、四肢及内脏，用Hanks液洗去体表血液，移入灭菌小烧杯中。（3）胚体匀浆用灭菌剪将胚体剪碎至1mm3小碎块。加入Hanks液（淹住组织碎块即可），轻摇，静置1-2min，待组织块下沉，吸去上层悬液。重复2-3次（以除去其中的红细胞），至上悬液不混浊为止，移入灭菌的小三角瓶中，吸去Hanks液。2、分散细胞（1）胰酶消化取出预热好的0.25%胰酶，向三角瓶中加入约8mL。包紧瓶口，37℃消化30min，每隔5min轻轻摇动1次。由于胰酶的作用，鸡胚细胞与细胞间的氨基和羧基游离。待液体变混而稍稠，轻摇可见组织块悬浮在液体内不易下沉，此时可中止消化。如再继续消化，可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。（2）分散细胞将消化好的细胞悬液从水浴锅中取出，弃去上层液体，加5mL含血清的DMEM生长液（DMEM营养液+5%犊牛血清+100IU/ml青链霉素，用7.5%NaHCO3溶液调pH7.2），以吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见生长液混浊，即为细胞悬液。静置1min后，使未冲散的组织块下沉。（3）过滤用4层脱脂纱布将吹打后的细胞过滤到平皿中，收集滤液。（三）分装与培养1、细胞计数用细胞计数器计数，根据计数结果，加入DMEM生长液，调整细胞浓度至50万-60万个/ml。（本实验省略此步）2、分装与培养在培养瓶中加入2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养瓶，加4mL生长液)，小心吸出过滤后的细胞悬液0.25mL至培养瓶中（如果是50mL的培养瓶，加0.5mL的细胞悬液)，吹打均匀盖好瓶塞。在瓶上注明组别、日期，置37℃温箱中培养(4h后细胞即可贴壁，24-36h生长成单层细胞，此时可更换培养液，并接种病毒)。分装后2-4h不可大幅度移动培养瓶，以免影响细胞的贴壁和生长。本实验培养3天，培养期间可每天观察1次。3天后取出，洗净培养瓶，放回实验室。（四）细胞形态观察检查时注意培养液的颜色变化，变黄但不混浊表示有细胞生长，变红表示细胞未生长或生长不佳。37℃培养24-48h后，于倒置显微镜下观察，细胞可以长成单层，细胞透亮，呈纤维状，细胞膜清晰。五、注意事项1、整个过程严格无菌操作2、培养液不要太多，应有足够的空间保证细胞对氧的需要3、放入CO2培养箱培养时，不要将盖子拧得太紧，并将CO2浓度控制在5%4、一般2d换一次培养液，细胞长成单层后要及时进行细胞传代5、细胞培养对玻璃器皿洗涤要求严格，彻底洗涤后用蒸馏水冲洗，再用双蒸水冲洗，干燥灭菌后备用。所有的溶液都要用双蒸水配制，所用药品试剂用分析纯。