甘蔗内生菌分离鉴定及功能多样性研究

龙源期刊网甘蔗内生菌分离鉴定及功能多样性研究作者：刘鲁峰寸海春何鹏飞狄义宁吴毅歆何丽莲李富生何月秋来源：《热带作物学报》2019年第06期龙源期刊网龙源期刊网摘;要;為探究甘蔗内生菌多样性组成及相关特性，本研究采用稀释涂板法分离并结合形态观察和分子标记（gyrB，rpoB，ITS，16SrDNA）进行鉴定。结果表明，从12个栽培品种（系）和5个野生种无性系的根、茎、叶组织中共分离到细菌589株、放线菌34株和真菌46株;细菌中固氮菌有41株，溶磷菌有98株，解钾菌有52株，对黄曲霉和禾谷镰刀菌具有拮抗作用分别有44株和35株。内生细菌分属21个属，其中芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和泛菌属为优势属;内生真菌分属于枝顶孢属、链格孢属、曲霉属、镰刀菌属、枝孢属等17个属，而放线菌仅为链霉菌属。具有潜在植物益生功能的菌株主要集中在芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、类芽孢杆菌属及泛菌属。本研究显示甘蔗栽培品种（系）和野生种无性系均含有丰富的内生菌资源，且栽培品种（系）所含内生菌在数量和多样性上均高于野生种无性系;12个栽培品种（系）间所分离到的内生细菌大部分相同，但也存在差异。通过初步的功能鉴定，筛选出一些具有应用潜力的益生微生物，为开发相应功能的生物菌剂奠定基础。关键词;甘蔗;内生菌;分离;鉴定;功能多样性中图分类号;S566.1;;;;;文献标识码;AAbstract;Toinvestigatethediversitycompositionofsugarcaneendophytesandthebeneficialcharacteristics，dilution-plating，morphologicalobservationandmolecularmarker（gyrB[gyrasebeta-subunit]，rpoB[RNApolymerasebeta-subunit]，ITS[integratedtranscribedspace]，16SrDNA）wereusedinthecombinationandseveralroomassayssuchasphosphate-，potassium-solubilizationsandantagonistismtests.Theresultsshowedthat589bacterial，34actinomyceticand46fungalstrainswereisolatedfromtheroot，stemandleaftissuesof12sugarcanevarietiesand5wildspecies，ofwhich41strainscouldfixnitrogen，98and52strainssolubilizephosphateandpotassiumrespectively，44and35strainswereantagonistictoAspergillusflavusandFusariumgraminearum，respectively.Theendophyticbacteriabelongedto21genera，amongthemBacillus，Burkholderia，EnterobacterandPantoeawerethedominant.Theendophyticfungiwereclassifiedinto17genera，Acremonium，Alternaria，Aspergillus，Ceriporia，Cladosporium，etc.，whileactiomyceteswasStreptomycesonly.ThestrainswithplantbeneficialpotentialsweremainlyclusteredintoBacillus，Burkholderia，Enterobacter，Pseudomonas，Acinetobacter，PaenibacillusandPantoea.Thestudyshowedrichendophyteresourcesbothinthesugarcanevarietiesandwildspeciesinterior，andthenumberanddiversityofendophytesinthecultivatedvarietieswerehigherthanthatofwildspecies.Mostoftheendogenousbacteriaisolatedfrom12sugarcanecultivarswerethesame，butthereweredifferences.Throughpreliminaryfunctionalidentification，someprobioticswithapplicationpotentialwerescreenedout，whichlaidafoundationforthedevelopmentofbiologicalagentswithcorrespondingfunctions.Keywords;sugarcane;endophyticmicrobe;isolation;identification;functionaldiversityDOI;10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.016龙源期刊网植物内生菌是指生活史中某一段生活在植物组织内，对植物没有明显病害症状的一类微生物，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[1-2]。19世纪中期，人们就开始了对植物内生菌的初步探索和研究，直到1977年Bacon等发现高羊茅内生真菌与牛的中毒症状有关之后[3]，植物内生菌的研究工作才引起广泛的关注。特别是1993年Stierle首次报道了从短叶紫杉的韧皮部分中分离出一株内生真菌（Taxomycesandreanae）能产生紫杉醇[4]，再次掀起了研究植物内生菌的热潮。目前各国科研人员已在80多个属中290多种禾本科植物发现有内生菌，在农作物和经济作物中的内生细菌已超过129种，54个属被报道，发现的内生细菌主要集中在芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）等[5]。内生真菌则主要集中在子囊菌类（Ascomycet）及其无性型[6]，内生放线菌则以链霉菌属（Streptomyces）、诺氏卡菌属（Nocardia）、小单胞菌属（Micromonospora）为主[7]。植物内生菌可以通过提高营养物质及矿物质的循环利用促进植物生长，改善土壤条件，提高化肥利用率，保护植物免受病原菌的侵害。目前研究表明植物内生菌具有固氮、溶磷和解钾功能，尤其是固氮作用研究较多，而内生固氮菌多为内生固氮细菌，大多分离自健康植物组织器官中，主要包括固氮螺菌（Azospirillumspp.）、重氮营养醋杆菌（Acetobacterdiazotrophicus）、多黏类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）、克雷伯氏菌（Klebsiellaspp.）、成团肠杆菌（Enterobacteragglomerans）、阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）、草螺菌（Herbaspirillumspp.）、固氮弧菌（Azoarcusspp.）、粪产碱菌（Alcaligenesfaecalis）、伯克霍尔德氏菌（Burkholderiaspp.）等[8]。而溶磷和解钾微生物更多的是从植物根际土壤中进行筛选分离得到，从植物中分离溶磷和解钾内生菌的研究相对较少。Chen等[9]从北京官厅水库的水生植物芦苇、菹草、睡莲和茨藻中分离获得了36株具有溶磷作用的细菌;郭莹等[10]从寒区富营养化水体中的健康穗花狐尾藻植株内分离获得了一株具有溶磷作用的沙雷氏菌属内生菌SP5。有时也能分离到兼具固氮溶磷解钾的多功能菌株，如阳洁等[11]从广西药用野生稻（Oryzaofficinalis）中筛选出4株具有高效溶磷解钾的内生固氮菌。植物内生菌在拮抗病原菌方面的研究也取得了长足进展。Strobel团队和Li团队分别证实了从雷公藤分离到的内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina对核盘菌、灰葡萄孢和稻瘟病菌等多种植物病原微生物有拮抗作用[12-13]。何红等从辣椒中分离到的108株内生细菌有约1/4的菌株对香蕉枯萎病菌、黄瓜枯萎菌有拮抗作用，其中1株枯草芽孢杆菌对植物炭疽病菌和番茄青枯病菌等有强烈的抑制作用[14-15]。袁军等从马铃薯中分离到40株内生细菌对环腐病菌有不同程度的拮抗作用[16]。Mitchell等从野生凤梨中分离的内生真菌Muscodorcrispans不仅对植物病原菌腐霉、樟疫霉、核盘菌、球腔菌有抗菌活性，对人的病原菌鼠疫杆菌、结核分枝杆菌和葡萄球菌也有抗菌活性[17]。王霞等从植物菘蓝中对分离到4株对植物病原菌禾谷镰刀菌、链格孢霉、大斑凸脐蠕孢有很强拮抗活性的内生细菌[18]。研究人员还从棉花、大蒜、酸枣等植物中分离到大量对病原菌有拮抗作用的内生菌。甘蔗是重要的糖料作物和能源作物，甘蔗内生菌最早发现于1961年，迄今已有10种以上的内生菌种属在美洲、澳洲和亞洲甘蔗体内被分离，国内外甘蔗内生菌研究大部分集中在固氮菌方面[19-21]，与甘蔗有关的溶磷解钾菌大多分离自甘蔗根际土壤[22]。学者们主要从甘蔗的龙源期刊网根际土或根或茎叶中分离甘蔗内生细菌[23-25]，对于甘蔗内生真菌及放线菌的分离研究较少，同时从甘蔗野生种及栽培种分离内生菌鲜有报道。我国甘蔗内生菌相关研究起步较晚，迄今为止未分离到适合我国生态条件下的稳定高效甘蔗内生菌互作模式菌株，而从国外引进的具良好特性的甘蔗品种在我国种植也难以获得在其原产地同样的高促生效率[26]。因此本研究从12个栽培品种（系）及5个野生种无性系的根、茎、叶中分离内生真菌、细菌、放线菌，并对分离到的内生菌进行分子鉴定，初步探讨甘蔗野生种及栽培种根、茎、叶部内生菌的多样性，并获得具有应用价值的益生微生物，为后续甘蔗的病虫害防治以及促生抗逆提供优良的菌种资源储备。1;材料与方法1.1;材料植物材料：12个甘蔗栽培品种/系——新台糖10、新台糖22、粤糖86-368、粤糖93-359、桂糖11、云蔗99-91、闽糖69-421、崖城89-9、滇蔗01-47、滇蔗01-58、滇蔗04-14、滇蔗09-38，代号分别设为ROC10、ROC22、YT86、YT93、GT11、YZ99、MT69、YC89、DZ47、DZ58、DZ14、DZ38;5个甘蔗野生资源无性系——割手密（Saccharum;spontaneum）、斑茅（Saccharumarundinaceum）、蔗茅（Erianthusfulvus）、五节芒（Miscanthusfloridulus）、河八王（Saccharumnarenga），代号分别设为SS、SA、EF、MF、SN。这些材料均种植于云南农业大学甘蔗研究所资源圃。菌株：植物病原真菌禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）及黄曲霉菌（Aspergillusflavus）、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderiacepacia）1-2菌株，均保存于本实验室。培养基：LB固体及液体培养基、PDA培养基、高氏一号培养基[27]、察氏（Czapek）培养基[27]、NBRIP培养基[10]、Pikovskaya（简称PVK）培养基[28]、Ashby无氮培养基[29]及Aleks