分子生物学基础知识

第一章分子生物学基础知识一、核酸分子的基本组成(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸核苷酸核苷碱基磷酸戊糖核糖脱氧核糖嘌呤嘧啶(一)碱基1、特性：②共轭性分子结构，共轭双键，260nm处有最大吸收NNNHN123456789嘌呤(purine)①弱碱性，低PH值时可接受质子NNH132456嘧啶(pyrimidine)③碱基间存在疏水堆积力2、种类和结构：①嘌呤NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤(adenine,A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤(guanine,G)NNH132456②嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)NNHNH2O尿嘧啶(uracil,U)NHNHOO胸腺嘧啶(thymine,T)NHNHOOCH3(二)戊糖（构成DNA）OHOCH2OHOH2、脱氧核糖(deoxyribose)（构成RNA）1´2´3´4´5´OHOCH2OHOHOH1、核糖(ribose)2－OH亲水极性集团易水解易受攻击RNA不稳定性无2－OH，DNA相对稳定(三)核苷戊糖C1嘌呤N9嘧啶N1糖苷键/糖甙键核糖核苷脱氧核糖核苷OHOCH2OHOHNNNH2O1´1＋(四)核苷酸POOOHOHOCH2OHOHNNNH2O1、核苷酸＝核苷+磷酸磷酸酯键戊糖+碱基+磷酸2、游离核苷酸NOCH2OOHOHNNNNH2POOHOPOOHOPOOHOHNOCH2OOHOHNNNNH2POOHOPOOHOHADPATPNOCH2OOHOHNNNNH2POOHOHAMP(五)核酸的一级结构1、定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5′端3′端CGA2、核苷酸链的方向性：PO4OH5′端3′端3、一级结构的表示方法——结构式/线条式/字母式AGP5PTPGPCPTPOH35pApCpTpGpCpT-OH35ACTGCT35′端3′端CGA磷酸基团3’5’磷酸二酯键羟基•DNA一级结构的基本特点•4种dNTP以3’、5’磷酸二酯键相连构成一个没有分枝的线性大分子。它们的两个末端分别称5’末端（游离磷酸基）和3’末端（游离羟基）。(六)DNA与RNA在组成上的区别DNARNA碱基AGCTAGCU戊糖脱氧核糖核糖结构双链大多单链，局部双链配对A＝TA＝UGCGC二、DNA的空间结构(一)DNA的二级结构——双螺旋结构1、特征①反向平行的双螺旋a.反向平行b.配对规律c.疏水碱基平面处于内侧，亲水戊糖与磷酸骨架处于外测②右手螺旋a.右手螺旋b.每周10个碱基，每对碱基36°，碱基平面距离0.34nmc.存在大沟、小沟(大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。)③稳定因素a.横向：氢键b.纵向：碱基疏水堆积力2、双螺旋结构的多样性ABZ(二)DNA的三级结构——超螺旋结构超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反多级螺旋模型压缩倍数76405（8400）DNA→核小体→螺线管→超螺线管→染色单体2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm一级包装二级包装三级包装四级包装三、DNA的功能(一)DNA的基本功能:1.以基因的形式荷载遗传信息，作为基因复制的模板，是生命遗传的物质基础。2.是转录的模板，是个体生命活动的信息基础。(二)基本概念:1.基因(gene)：携带遗传信息的一段特定的核苷酸序列，可自我复制并指导转录。2.基因组(genomic)：一个生物体所包含的全部遗传信息的总和，即全部DNA序列。3.遗传密码(geneticcode)：DNA碱基序列与蛋白质的氨基酸序列之间存在的对应关系。起始密码(ATG)AUG终止密码：UAAUAGUGA四、RNA的结构(一)RNA的结构特征:1.组成：核糖碱基——AUCG2.单链，局部形成双链。3.含稀有碱基较多——DHU(二氢尿嘧啶)，Tф（假尿嘧啶），甲基化，甲羟化，乙酰化等(二)RNA的种类:1、参与基因表达的RNA①信使RNA（mRNA）：遗传信息的传递，翻译模板②转运RNA（tRNA）：氨基酸载体③核糖体RNA（rRNA）：提供蛋白质合成的场所2、核不均一RNA（hnRNA）:mRNA的前体3、核内小RNA（snRNA）：参与hnRNA的剪接、转运4、核仁小RNA（snoRNA）：参与rRNA的加工修饰5、胞质小RNA（hnRNA）:运输新合成的Pr到高尔基体加工6、小片段干扰RNA（siRNA）：诱发外源mRNA的降解五、核酸的理化性质及应用(一)一般理化性质1、粘度DNARNA2、沉降系数DNARNA3、酸碱性质DNApI4~4.5，pH4.0~11.0稳定，提取pH8.0RNApI2~2.5提取pH4.5左右，混有很少DNA污染(二)紫外吸收特征1、碱基的行为表现——共轭双键在260nm有最大吸收2、应用①测定浓度OD260=1.0相当于双链DNA50μg/mL单链DNA（或RNA）40μg/mL寡核苷酸20μg/mL②判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0③测定是否变性（增色效应）DNA完全变性增加25～40％RNA变性增加1.1％左右增色效应(hyperchromiceffect)由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。4、复性：变性的DNA在适当的温度、一定离子强度条件下，给以足够的时间重新缔合形成双螺旋的过程，称为复性。5、影响复性的因素：①T：Tm－20～26℃②离子强度：降低带同种电荷单链间的排斥③DNA浓度④DNA复杂程度6、分子杂交：不同来源的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下可以按碱基互补原则形成双链的过程。六、遗传中心法则转录翻译DNARNA蛋白质逆转录基因表型控制基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。基因表达(geneexpression)translationDNAmRNAproteintranscriptionDNARNAtranscriptionDNA无组织特异性基因表达有组织特异性核酸生物合成的一般规律1按照碱基互补配对原则，以DNA为模板，逆转录以RNA为模板25’→3’方向，通过磷酸二酯键连接3特异的聚合酶催化4聚合酶的底物核苷酸要求是5’核糖或脱氧核糖5RNA聚合酶进行聚合反应时，可从头合成RNADNA聚合酶进行聚合反应时，要有3’-OH末端(一)DNA的复制复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，以dNTP为原料，按照碱基互补原则合成子链DNA的过程。15N链14N链重氮环境15N轻氮环境14N3535解链方向1、复制的方式：①母链双螺旋解链，以母链的两条单链为模板，半保留复制②以四种dNTP为原料③碱基互补配对规律④子代DNA双链与母链碱基序列一致⑤5’→3’方向，通过磷酸二酯键连接2、复制的条件：①substrate:dATP,dGTP,dCTP,dTTP②template:解开成单链的DNA母链模板③primer:提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合④enzyme：a、DNA聚合酶b、DNA连接酶c、引物酶d、解螺旋酶和拓扑异构酶(三)转录转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。mRNA把遗传信息从染色体内贮存的状态转送至胞质，作为蛋白质合成的直接模板。转录RNADNA七、氨基酸•蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。自然界存在的成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性主要由氨基酸的内在性质造成的。(一)氨基酸的分类:•生物体中发现的氨基酸180多种，大多数是不参加蛋白质组成，这些称为非蛋白质氨基酸。•蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有20种，称为蛋白质氨基酸。•存在某些蛋白质的不常见氨基酸都是肽链上由常见氨基酸修饰转化而来。常见的蛋白质氨基酸苏氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GlutarnineGlnQ天冬氨酸AsparticacidAspD谷氨酸GlutamicacidGluE赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH中文名称英文名称三字母缩写单字母符号甘氨酸GlycineGlyG丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸IsoleucineIleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW丝氨酸SerineSerS中文名称英文名称三字母缩写单字母符号按R基的化学结构分类1.脂肪族aa（1）中性aa甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸含羟基或硫aa丝氨酸半胱氨酸苏氨酸甲硫氨酸胱氨酸由两个半胱氨酸通过侧链上的-SH基氧化成共价的二硫键连接而成（３）酸性aa及其酰胺天冬氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰胺（４）碱性aa赖氨酸精氨酸２、芳香族aa苯丙氨酸络氨酸色氨酸３、杂环aa组氨酸脯氨酸(三)氨基酸的酸碱性质:如果AA在晶体或水中主要以兼性离子（偶极离子)形式存在，不带电荷的中性分子为数极少，就很好解释这个问题了。静电吸引＞范德华力兼性离子形式的AA是强极性分子(四)AA的光学活性和光谱性质1.AA的光学活性和立体化学a-氨基酸的a-碳是一个不对称原子（除了甘氨酸），因此具有旋光性。也分为两种构型D型和L型苏氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸和羟赖氨酸除了a-碳原子外，还有第二个不对称碳原子。因此有四种光学异构体。它们分别称为L-，D-，L-别-，D-别-氨基酸。L-苏氨酸D-苏氨酸L-别-苏氨酸D-别-苏氨酸2HN-C-HCHOCOOHHCH3COOHH2N-C-HCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOH2HN-C-HCHOCOOHHCH32HN-C-HCHOCOOHHCH3COOHH2N-C-HCCH3HOHCOOHH2N-C-HCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOHCOOHH2H-C-NCCH3HOH氨基酸的旋光性氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基性质，并且与测定的溶液pH有关，这是因为在不同的pH条件下氨基和羧基的解离状况不同。pH对L-亮氨酸（蓝）和L-组氨酸（红）的[a]D25值的影响比旋是a-氨基酸的物理常数之一，是鉴别氨基酸的一种根据-40-30-20-10010203003456789pH比旋率2.氨基酸的光谱性质•紫外吸收光谱可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（200—400nm）：芳香族氨基酸Tyr/Trp/Phe才有吸收原因：含有苯环共轭p键系统-C=C-C=C-C=C-C=C-蛋白质最大吸收在280nm蛋白质含量测定Trp280nmTyr275nmPhe257nm分光光度法定量原理e:摩尔吸收系数，c:浓度；l:吸收杯的内径或光程厚度；I0：入射光强度；I：透射光强度•核磁共振波谱核磁共振应用最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子核的磁矩,误差仅是0.003%～0.005%;迄今,它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研究工作的有力工具,甚至是某些领域(如:化学、医