课题3-分解纤维素的微生物的分离

课题3分解纤维素的微生物的分离课题背景纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。在本课题中，我们将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。基础知识（一）纤维素与纤维素酶棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物（图2-11），此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、不溶于水的微晶纤维素（Avicel）等。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。下面我们通过一个小实验来体会纤维素酶的作用。在2支20mL的试管中，分别放入1cm×6cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸—醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（70~80U/mL）。将2支试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。你也可以用报纸、复印纸做这个实验。如果没有摇床，你可以采用定时人工振荡的方法。时间足够长时，你会观察到滤纸被完全分解（图2-12）。1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。（二）纤维素分解菌的筛选在寻找微生物的过程中，人们希望能用一些简便直接的方法，找到所需要的微生物，同时筛掉不需要的微生物，就好像用筛子筛沙一样。在筛选纤维素分解菌的过程中，人们发明了刚果红染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。刚果红（CongoRed，简称CR）是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加人刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈（图2-13）。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。实验设计请你根据实验流程图（图2-14）和提供的三个资料，思考有关问题，然后进行实验设计，并写出详细的实验方案。本实验流程与课题2中的实验流程有哪些异同？[资料一]土壤取样根据经验，纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，因此，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶，等等。你还可以将富含纤维素的物质，如滤纸等，埋在土壤中。经过30d左右，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？[资料二]选择培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，可以通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。请分析旁栏中的培养基配方，回答下面的问题。纤维素分解菌的选择培养基配方：纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。鉴别纤维素分解菌的培养基配方：CMC-Na5~10g酵母膏1gKH2PO40.25g琼脂15g土豆汁100mL将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。1.旁栏给出的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？2.这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？3.你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？[资料三]刚果红染色法常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。方法一在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/mL的CR溶液，10～15min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。方法二配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。想一想，这两种方法各有哪些优点与不足。你打算选用哪一种？操作提示（一）复习微生物技术做这个实验前，请你先复习课题1和2中学习过的方法，主要包括培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取样等。（二）选择培养的操作方法将土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2d，直至培养液变混浊。吸取一定的培养液（如5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。吸取适量的培养液，稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？如果没有摇床，可以采用定时人为摇晃锥形瓶的办法。结果分析与评价1.你选用了哪种实验样品来分离纤维素分解菌？取样的环境有哪些特点？作出这种选择的理由是什么？2.培养基中有杂菌污染吗？你是否分离到了能够产生透明圈的微生物？它们是纤维素分解菌吗？3.比较你的分离结果与其他同学的有什么不同。分析产生不同结果的原因。课题延伸本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选。但是，这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。练习1.请在查阅资料的基础上，写一篇科普短文，介绍分解纤维素的微生物在生产和生活中的应用。2.学完这个专题后，你能否总结出分离培养微生物的一般方法？请用流程图表示。