胍丁胺修饰的阳离子型可降解聚富马酸-乙二醇共聚物水凝胶的合成、表征以及细胞粘附作用研究

生物大分子2002,3,1030–1037胍丁胺修饰的阳离子型可降解聚富马酸-乙二醇共聚物水凝胶的合成、表征以及细胞粘附作用研究KazuhiroTanahashi,SeongbongJo,AntoniosG.Mikos我们通过胍丁胺改性聚乙二醇-富马酸(Agm-PEGF)和聚富马酸丙二醇酯-乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))交联合成带正电的可生物降解水凝胶，以研究胍丁胺的胍基对水凝胶溶胀特性，以及对平滑肌细胞粘附能力的影响。Agm-PEGF相对于P(PF-co-EG)的初始浓度分别从0增加到200mg/g，在pH=7.0的情况下，水凝胶的溶胀率从279±4%增加到306±7%。在Agm-PEGF的初始浓度分别为0、100和200mg/g时，扩散指数n分别为0.66±0.08，0.71±0.07，和0.60±0.05，且在吸水初始阶段与Agm-PEGF的含量无关。Agm-PEGF的初始浓度从0增加到200mg/g时，反应中水凝胶的溶解热从214±11增加到254±4J/g。Agm-PEGF的初始浓度从0增加到200mg/g时平滑肌细胞附着数量相对于最初密度，从15±6%增加到75±7%。这些结果表明,胍丁胺的胍基与(P(PF-EG)结合增加了水凝胶自由水的含量和水的总含量，还增强了粘附细胞的能力。前言携带阳离子团的聚合材料可用作细胞载体[1]，与血液兼容的涂层[2]，抗菌材料[3]，和药物输送系统[4,5]。磷脂类和蛋白聚糖类的细胞表面带负电，阳离子修饰的聚合材料可增强细胞粘附[1]。Mori等人论证，用阳离子聚合物进行表面改性的医疗器械会负载肝素,将逐步释放肝素从而减少了血栓形成[2]。奥古斯塔等人报道，蔗糖修饰的甲基丙烯酸酯水凝胶，用季铵盐改性后表现出对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的杀菌作用[3]。聚阳离子如聚精胺，聚(L-赖氨酸)和聚(2-甲基丙烯酸二甲胺乙酯)可作为基因载体[4-5]。目前，各种水凝胶已经研究出用作不同的应用，例如细胞组织再生的载体。生物降解和生物兼容性被认为是组织工程中水凝胶材料设计的关键参数。然而，以前研究的阳离子水凝胶不可降解。此外，水凝胶因阳离子单体存在毒性，应用受到限制。胍丁胺是由精氨酸通过精氨酸-脱羧酶天然合成，通过的鲱精胺酶水解代谢成为腐胺和尿素。各种人体组织如大脑、肺、胃、和脾脏中已经检测到胍丁胺,在人体血清中出现的浓聚物少于100ng/mL。在较高浓度下，胍丁胺通过咪唑啉结合位点和α2肾上腺素能受体也展现不同的生物效应[6-8]。胍丁胺在生理浓度下的功能并不完全了解。然而，胍丁胺在1mM的浓度下没有表露出任何细胞毒性，而老鼠实验模型中致死剂量为1–10mg/kg[6]。胍丁胺有两个功能基团：一个胍基和一个初级氨基。胍基的pKa值是12.5，能够在较大的pH值范围内质子化。此外，氨基的亲核性对耦合反应是很有用的。聚富马酸丙二醇酯-乙二醇共聚物P(PF-co-EG)可作为生物降解聚酯的注射剂[9-15]。富马酸的双键能发生与共聚物的交联反应。在含水交联时，很小的温度增加都会使得P(PF-co-EG)适合作为一个细胞载体。实验证明，水凝胶包含有P(PF-co-EG)和N-乙烯吡咯烷酮会大块的分解。当P(PF-co-EG)水凝胶植入到大鼠皮下，它几乎不会引发炎症反应[11-13]。然而，当增加P(PF-co-EG)共聚物中乙二醇重复单元相对于丙烯富马酸酯重复单元的相对摩尔比例时，P(PF-co-EG)水凝胶的亲水性增加，细胞在水凝胶表面的粘附能力下降[15]。因此，如作为细胞载体，在共聚物进行原位交联后用作的栓塞，凝胶就要进行增强细胞粘附能力的改性[15]。为提高细胞粘附到P(PF-co-EG)水凝胶上的能力，我们设计用胍丁胺改性的P(PF-co-EG)水凝胶。因为细胞可能增长在水凝胶的表面上以及内部，我们对P(PF-co-EG)水凝胶进行了很大的改动。我们使用P(PF-co-EG)共聚物和可降解的大分子胍丁胺单体用交联的方法制备支持细胞粘附的水凝胶。在本研究中，我们合成一个胍丁胺修饰的聚乙二醇大分子单体，使制备的P(PF-co-EG)凝胶带正电。我们进一步研究了在P(PF-co-EG)水凝胶溶胀过程中，胍丁胺的正电荷起到的影响。实验部分材料：富马酸二乙酯,丙二醇,聚-乙二醇,琥珀酸酐、无水吡啶、无水二氯甲烷,N-羟基琥珀酰亚胺,奥尔德里奇(密尔沃基,WI)购买的二环己基碳二亚胺。阿克罗斯(匹兹堡，PA)购买的对苯二酚。氯化锌、二氯甲烷,异丙醇、正己烷、甲苯、乙醚被费舍尔科学(匹兹堡，PA)购买。硫酸胍丁胺,溴酚蓝,抗坏血酸被购买从西格玛(密苏里州圣路易斯)。人主动脉平滑肌细胞株(CRL-1999)(弗吉尼亚州马纳萨斯)。杜尔贝科的改性伊格尔培养基(DMEM)和磷酸盐缓冲液(PBS)是购自格兰特岛生物群体/生命技术(盖瑟斯堡,MD)。胎牛血清是在Bioproducts(Calabasas,CA)购买的。共聚物的合成。聚富马酸丙二醇酯(PPF)的合成如前所述[16]。简单地说,富马酸二乙酯是将3mol丙二醇过量加入对苯二酚、氯化锌混合溶液剧烈反应升温至160°C。这个反应在氮气层下进行。酯交换的中间体富马酸二酯是在150°C一个真空0.1mmHg下剧烈的搅拌进行。摩尔分子量为600的聚乙二醇是在同样条件下形成共聚物。产生的共聚物在二氯甲烷和异丙醇溶液里进行沉淀。用分液漏斗分离再减压干燥回收共聚物。共聚物的分子重量通过凝胶渗透色谱(GPC)测定。聚乙二醇合富马酸酯合成：100g(0.6mol)富马酸二乙酯加入350g分子量300(PEG300)(1.2mol)聚乙二醇在0.4g对苯二酚和1.5g氯化锌混合液中剧烈反应至160°C。反应在氮气保护下进行5h。产物用5体积的异丙胺/正己烷(2:3)冲洗。聚乙二醇合富马酸酯(PEGF)与溶剂用分液漏斗分离再减压干燥。PEGF的分子重量是由GPC测定。硫酸胍丁胺与聚乙二醇合富马酸酯的合成：100g(0.1mol)PEGF和800ml甲苯共沸蒸馏干。33g(0.3mol)琥珀酸酐和27mL(0.3mol)无水吡啶溶解到700mL无水二氯甲烷,然后加入蒸干的PEGF。反应混合物升温至60°C回流24h。溶剂用旋转蒸发转移并且残渣用乙醚洗涤两次。然后溶解到220mL无水二氯甲烷/二乙基醚(3:5)，残渣在-15°未反应的琥珀酸酐中沉淀1h。然后通过过滤除去未反应的琥珀酸酐，蒸发溶剂得到琥珀酸化的PEGF。30g(0.03mol)琥珀PEGF和9.6g(0.08mol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶入500mL无水二氯甲烷。17g(0.08mol)二环己基碳二亚(DCC)溶入100mL无水二氯甲烷。反应在室温下剧烈搅拌反应24h。然后过滤除去沉淀的二环己基脲,较纯产品通过旋转蒸发得到。用乙醚洗涤得到活性琥珀PEGF与NHS(NHS-PEGF)。产品进一步蒸干除去剩余的醚。5g（5mmol）NHS-PEGF溶解在25mLN,N二甲基甲酰胺(DMF)中。然后2.2g(10mmol)硫酸胍丁胺溶解在50mL0.1N碳酸氢钠缓冲(pH值8.3)中，冰浴下把前溶液滴入后溶液，然后在室温下搅拌29h。混合物用75mL去离子的蒸馏水(蒸馏水)稀释，溶液转移到纤维素酯透析膜(SpectroPro截留分子量500)，室温下用蒸馏水进行3天透析。透析后，在75°C下旋转蒸发除去蒸馏水。减压干燥得到胍丁胺改性PEGF(Agm-PEGF)。PEGF,琥珀PEGF,NHS-PEGF,Agm-PEGF用1HNMR谱仪(Bruker交流400MHz宽孔核磁共振波谱仪)检测。水凝胶的合成。交联是在氧化还原引发剂通过基团反应完成的。典型实验，1g数均分子量5300的P(PF-co-EG),不同含量的Agm-PEGF,和100íL、1M过硫酸铵溶解在2mL的蒸馏水中。PEGF添加到溶液中调节Agm-PEGF总分子量，而PEGF达到200mg。然后,把100mL、1M抗坏血酸加入溶液。两个玻璃杯加一个薄膜基体,注入合成的溶液通过1mm间隙来分离。在37°C很快完成交联。这些膜剂沉浸在蒸馏水一夜之间与周期性介质的变化除去未反应的聚合物和大分子单体。溶胀的膜被切成不同直径的圆片用于进一步分析。溴酚蓝染色法测量胍丁胺含量。5mg溴酚蓝(BPB)溶于45mL、10mMTris–HCl缓冲液（pH值为6.8）制成溴酚蓝(BPB)溶液。加蒸馏水凝胶的直径增长4mm。37°C下水凝胶在2mLBPB溶液中染色25h。剩余BPB10mM在室温下用Tris–HCl缓冲液（pH值为6.8）清洗除去。染色水凝胶放入一个96孔聚苯乙烯微孔板中。BPB的吸光度是用功率波X340微孔板扫描分光光度计(宝特仪器Winooski,VT)与KCjunior分析软件测量在590和700nm内。因为BPB在590nm有最强的吸光度,在700nm没有吸光度,图正确的吸光度是在700nm的吸光度减去在590nm的吸光度。10mMTris–HCl缓冲液（pH值为6.8）处理没有加BPB的水凝胶作为对照。对于一个定量分析,一个标准曲线通过测量BPB标准溶液的吸收度得到,用10mMTris–HCl缓冲液（pH值为6.8）配制不同浓度的BPB溶液。各取28微升BPB溶液放置到96孔微孔板再放一个体积相同厚度约为1mm肿胀的水凝胶。Agm-PEGF水凝胶的含量用吸光度数据,干重的水凝胶,BPB和Agm-PEGF分子的重量(691.95和1068,分别)进行计算。溶胀比测量。水膨胀性的水凝胶(直径4mm)晾干48h，然后水凝胶干重测量。溶胀水凝胶的重量是干膜在25°C离子浓度为0.1M不同pH的缓冲液中溶胀超过24h后测量。下面的缓冲液用于这个实验:pH=5.0醋酸钠缓冲液,pH=6.0和pH=7.0磷酸钠缓冲液,pH=8.0和pH=9.0盐酸三缓冲液。氯化钠被用来调节离子浓度为0.1M。溶胀比是使用公式计算:溶胀比(%)=(湿重)/(干重)X100。水凝胶降解。水凝胶降解取决于重量法。水凝胶溶胀8.5mm直径如上所述获得。水凝胶被放置在pH值分别为5.0,7.0，9.0温度37°C、2mL缓冲液旋振筛中。所有样本的缓冲液每隔12小时改变直到第三天,此后每一天保持相对恒定的pH值。水凝胶放置3和7天,用蒸馏水冲洗,晾干48h。测量的干重量/初始干重量。差示扫描量热法。差示扫描量热法(DSC)分析用TA仪器公司2920型调制差示扫描量热法与机械冷却件(NewCastle,DE)，如前所述[9]。干水凝胶膜(4mm直径)肿胀在pH=7.0磷酸钠缓冲液中。溶胀的膜(8–10mg)放入铝锅、密封气,然后用液氮冷却1min。锅中以5°C/分钟从-60°C到+50°C加热。PEG结晶焓取决于放热峰面积。因为PEG结晶融化使内温从-20°C升到+15°C，水的熔解热(ΔHf)通过PEG结晶焓减去整个吸热峰面积得出。水扩散到水凝胶。水膨胀性的水凝胶(直径5.5mm)如上所述蒸干。25°C时干水凝胶放入一个pH=7.0离子浓度0.1M磷酸钠缓冲液。然后以0.5、1、2、3、4、510、20、30、60和180min函数时间浸入，再测量吸收水增加的重量。吸收水在平衡状态超过24小时后浸没。以下方程是用来描述P(PF-co-EG)水凝胶膜的扩散过程。在这个方程中,Mt和M∞分别对应吸收水在时间t和平衡状态。常数k与水凝胶的结构相关,n是扩散指数，是ln(Mt/M∞)和ln(t)线性回归的斜率。平滑肌细胞的附着实验。在37°C用10%胎牛血清（FBS）湿度5%CO2的DMEM中培养平滑肌细胞，再加入浓度为50mg/mL抗坏血酸作为介质。细胞通道3用于附着力的研究。直径20mm的凝胶薄片用无水酒精在12孔板上消毒超过12h。每个薄片沉浸在2mLPBS12孔组织培养皿中隔夜除去乙醇。然后薄片用2mLPBS冲洗两次，不锈钢环(外径2.2mm,内径1.6mm,高1.6mm)放在薄片上部，防止薄片漂浮。平滑肌细胞悬浮在10%胎牛血清（FBS）培养基里。1mL细胞悬液放置到