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实验一清洗与灭菌一、实验目的：能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品1．材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22μm，过滤器(直径25)。2．药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)。3．仪器：超净台，干燥箱，高压蒸气灭菌锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2．使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液过夜。(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。(5)包装(牛皮纸或一般纸)。(6)高压(15磅20min)或干热(170℃2h)灭菌。(7)贮存备用。3．胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20min。(2)自来水清洗10次。(3)再用1％稀盐酸浸泡30min。(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。（二）消毒1．物理消毒法(1)紫外线消毒用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。(2)干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8h。(3)湿热灭菌此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。(4)滤过除菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90mm、100mm、142mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20mm、25mm等)。滤膜孔径有0．60μm、0．45μm、0．35μm、0．22μm、0．10μm等，以0．22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。2．化学消毒法常用的消毒液有如下几种：(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3d后方可达到消毒空气的目的。3．煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。五、注意事项1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。．3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。实验二、原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒实验步骤1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。实验三、传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。实验材料与试剂（1）材料：原代培养细胞。（2）设备与用品：倒置显微镜，CO2培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤器及0.22μm的水相滤膜，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，酒精灯，试管架等。（3）药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血清；0.25%胰蛋白酶（w/v,PBS缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4）。强酸洗液的配制：先用约200mL蒸馏水充分加热溶解重铬酸钾63克，再缓缓加入1L浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解。洗液腐蚀性较强，操作时注意做好各方面的防护，并且动作要轻柔，注意安全。当洗液的颜色由棕红色变为绿色时表明已经失效，需重新配制。4.实验方法与步骤实验内容：体外培养细胞的观察及细胞的传代培养。（1）培养基等的配制及实验用品的清洗与消毒配制RPMI-1640培养基及0.25%胰蛋白酶（w/v,PBS缓冲液配制pH7.4）溶液，并过滤除菌后培养验菌。清洗，包装并高压灭菌细胞培养的玻璃用品等。细胞培养的玻璃器皿等进行初步清洗后要用强酸洗液浸泡过夜，然后用蒸馏水彻底冲洗干净；进行湿热灭菌时一般需至少灭菌40分钟；培养过污染细胞的培养瓶则最好加上用煤酚皂溶液浸泡过夜的步骤；移液管和吸管在包装前要在其管口用细丝或镊子塞上少许棉花，长约1~1.5cm，松紧要适宜。（2）动物培养细胞的形态观察倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。同时可对比观察教师事先准备的污染细胞、死亡细胞，并对培养细胞的密度有一定感性的认识。（3）消化：倒掉旧培养基，加几滴胰酶润洗一下，立即倒掉，再加适量胰酶消化1~2分钟左右，可镜下观察待细胞胞质回缩，细胞间空隙变大时立即停止消化。（4）悬浮细胞：沿着培养瓶无细胞的一面倒掉胰酶，加适量培养基，用吸管充分吹打后，镜下观察是否还有贴壁细胞。（5）分装：一般以1：2或1：3进行分装，即一瓶细胞可传为2~3瓶。向分装好的各瓶细胞中再加入适量的含10%（v/v）血清的RMBI-1640培养液。（6）拧上盖子（勿拧紧），做好标记，将培养瓶平放于培养箱中，于37℃，5%CO2下培养。5.实验注意事项（1）要保证实验中的无菌操作，就必须特别注意一些操作上的细节，比如：培养液等不要过早开瓶；加液时取液用的移液管、吸管勿碰用过的培养瓶瓶口；要勤过火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位置；超净台中物品的摆放要合理，尽量避免双手交叉取物；若有动作失误，勿存侥幸心理，应及时更换移液管等。（2）对于贴壁细胞的传代培养胰酶的消化步骤是关键，要注意胰酶消化的时间也不能过长，否则不但造成细胞数目的损失，也会对细胞造成损伤，使细胞不易贴壁生长。（3）可根据细胞的密度，生长速度及实验周期的要求等适当调整细胞的接种密度。但细胞若接种密度过低，也会造成细胞生长极为缓慢甚至停止生长。