电泳技术(1)

第六章电泳技术前言1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。瑞典Uppsala大学物理化学系Svedberg教授提出了荷电的胶体颗粒在电场中移动的现象称其为电泳（electrophoresis）。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。50年代起，出现了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，80年代发展起来的新的毛细管电泳技术。第一节电泳的基本原理生物大分子物质如蛋白质和核酸，常以胶体颗粒的形式分散在溶液中，并带有一定的正电荷或负电荷，他们的净电荷取决于介质的pH值。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极移动，移动的速度和分子的形状大小、分子所带的电荷及分子的生物学性质有关，依据此性质可以将不同两性分子分离。溶液酸碱度影响蛋白质带电的性能。迁移率(mobility)的定义：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.m:迁移率，cm2/V˙sν:泳动速度，cm/sE:电场强度,V/cmd:泳动距离,cmt:电泳时间,sV:电压常压(100—500v)l:支持场的长度(有效长度)VtdllVtdEvm颗粒在溶液中迁移的驱动力：颗粒的有效电荷和电位梯度。他们与介质的摩擦力抗衡，在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律F=6πrvηF摩擦力r颗粒的半径v移动的速度η介质的黏度影响电泳速度的因素颗粒性质:直径、形状、静电荷。电场强度:电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm溶液性质:电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶液黏度。离子强度:0.02-0.2,若离子强度过高，会降低颗粒的迁移率。原因：带电粒子吸引周围的离子形成扩散层，导致颗粒增大阻力增大，迁移率降低。离子强度过低，缓冲能力差，溶液PH值变化影响迁移率。电渗:在电场作用下，液体相对固体支持物的移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。焦耳热:电位梯度一定时，电流强度与电导率成正比。在电泳过程中，电流越大，放出热量也越多。这会引起区带扩散，影响分辨率。溶液中离子强度越高，电流强度越高，产热越多，影响分辨率。筛孔:筛孔越大的介质，颗粒泳动速度越快。IE第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳，是目前最常用的电泳方法。2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点设备简单样品量小（1-100微克）时间短（30-60分钟）操作方便分离范围广（多肽，蛋白，多糖等）可提高灵敏度改为超微量测定（10-12-10-9）可用于蛋白质分子量2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳原理以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。2.2.1不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应样品的浓缩效应凝胶的分子筛效应电荷效应这三种效应的结果使得样品中各组分达到良好分离，例如：人血清纸电泳5-8个条带，PAGE电泳20-30个条带。A.样品的浓缩效应（1）凝胶层的不连续性电泳凝胶有两部分组成：浓缩胶和分离胶。蛋白质在大孔凝胶（浓缩胶）中受到的阻力小，移动速度快。到分离胶的界面时，由于分离胶的孔径小阻力大，速度就减慢了。由于其不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处样品得到浓缩，区带变窄。（2）缓冲液离子成分的不连续性电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方向移动，若迁移率不同，两种离子能形成界面，则走在前面的离子称快离子（先行离子），走在后面的离子称为慢离子（随后离子）。通常氯离子为快离子，甘氨酸根离子为慢离子，TRIS为缓冲配对离子。pI=6.0pKα1=2.34pKα2=9.70快离子慢离子和蛋白质样品的有效迁移率次序为：Cl-Pr-Gly-。（3）电位梯度的不连续性电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。电导与电位梯度成反比。（4）pH的不连续性浓缩胶与分离胶之间有PH的不连续性，从而控制慢离子的解离度，在浓缩胶中慢离子解离度低，在分离胶中解离度高。pH大孔(浓缩)胶6.8小孔(分离)胶8.8B．分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分布的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，成为分子筛效应。小分子走在前，大分子走在后。C．电荷效应电荷越多，泳动速度越快。2.3聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备2.3.１、性能:稳定、机械强度好、纯度高2.3.２、制备原理：2.3.２.１制备原料：丙烯酰氨（Acr)，亚甲基双聚丙烯酰胺(Bis)CH2=CH—CONH2+CH2=CH—CCH2=CH—C—CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2——CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CONH2C=OCH2NHNHOOCONH2C=ONH2.3.2.2聚合方式化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED(加速剂)光聚合:核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶3．凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度（T）：丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的总百分浓度。交联度（C）：亚甲基双丙烯酰胺（b),丙烯酰胺(a)。(%)100mbaT(%)100babC有效孔径取决于凝胶总浓度T%，有效孔径随T%的增加而减小。有效孔径决定蛋白质的分离有效孔径与交联度(C%)有关。随交联度的增加而减小。分离不同分子量样品所应选择的凝胶浓度分子量范围适用的凝胶浓度/(%)10420-30(1-4)×10415-204×104-1×10510-15(1-5)×1055-105×1052-5三、电泳后的检测氨基黑10B法：是一种酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。氨基黑染料染SDS-蛋白质效不好。染不同蛋白时，色度不等，色调不一（蓝、黑、棕），纯度扫描时误差太大。考马斯亮蓝R250：灵敏度是氨基黑10B的5倍，但不适用于酸溶蛋白、醇溶蛋白。考马斯亮蓝G250：灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液，本低无色。ANS法：1-苯胺基-8-萘磺酸，本身无荧光，与蛋白结合后产生荧光，电泳后，取胶置平皿中，用此染料溶液浸1-3分钟，在紫外灯下观察，黄色。检测限100微克，如果不明显，将胶取出暴露空气中或浸在3摩尔盐酸溶液中2分钟，使蛋白表面稍变性，然后染色，检测线提高到20微克。染色后酶和抗体能保持活力。可用来测定酶活或者作抗原注射动物。银染法：机制：蛋白质上的各种基团（如琉基、碳基等）能与银离子结合，然后再将银离子还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。银染应先固定，固定的作用有两个方面：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。染色分为双胺银染和非双胺银染。双胺银染过程：1胶在50%甲醇中浸泡至少1小时2配制溶液A：0.8克硝酸银到4毫升无离子水。B：21毫升0.36%氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔的氢氧化胺3染色：将A滴到B中，用无离子水加至100毫升，此溶液临用前配制，染色15分钟4洗涤：无离子水漂洗5分钟5显色液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，加无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。6无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的装置DYCP-31C型微型琼脂糖电泳槽(桥式）第三节SDS-PAGE(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis)概述：1967年建立，1969年完善。在样品和聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS后，蛋白质分子的迁移率就取决于它的分子量大小，因此可用来测定分子量。几种电泳方式的比较：管状凝胶电泳，垂直板凝胶电泳，水平薄层凝胶电泳。3.1SDS电泳的原理SDS的性质：表面活性剂、带负电。蛋白质的形状：球状、线状。SDS与蛋白质结合后的状态：椭圆棒,蛋白质的分子量仅与长度有关。电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系：LogMW=-b×mR+K3.2影响蛋白质与SDS的结合程度的因素溶液中SDS单体的浓度样品缓冲液的离子强度二硫键是否完全被还原3.3SDS聚丙烯酰氨凝胶的组成与聚合凝胶分为均匀胶和梯度胶两种.梯度胶可提高蛋白质分子量的分离范围：10%-15%适合于1-25万MW配胶时应注意：1丙烯酰胺的质量2尽量减少AP，TEMED的量.3控制聚合时间（40-60分钟）温度30-50度4室温放置12小时3.4样品的制备样品缓冲液的组成：甘油，溴酚蓝，还原剂（DTT），SDS，TRIS-HCL样品处理：加热变性特殊样品的处理：上样浓度：考马斯亮蓝染色：20-30纳克/微升银染：0.3-0.5纳克/微升3.5分子量测定标准蛋白:蛋白标准的结构与行为尽可能与待测样品接近，分子量范围略高和低于未知蛋白。用相同的条件和方法制备样品和标准品，然后在分离和混合状态下一起电泳（在同一张电泳板上）。分子量测定：相对迁移率=蛋白迁移的距离/溴酚蓝迁移的距离。LogMW=-b×mR+K3.6SDS电泳测定分子量的局限性测得分子量为亚基的分子量.不适合于电荷异常或结构异常蛋白.3.7应用实例中国药典2015版收载药品本实验室样品的电泳中国药典2015版通则05413.8低分子量多肽的SDS电泳常规PAGE电泳不适合分离15KD以下多肽原因如下：1.SDS-多肽胶束大致是球形，长度和直径在同一个数量级。2.较高的内部电荷不能被覆盖。改变以下条件可以测定小分子的多肽：增加胶联度：swank,11个多肽，18%的误差。加入尿素：williams,观察到分子量小于6000的多肽在普通电泳中的相对迁移率是一样的。只有在胶联度10%，且加入8摩尔尿素时才能得到好结果。增加缓冲液的浓度，慢离子改为TRICINE：可使电泳的适用范围：1-100KD思考题:比较以下几种分子量测定方法的优缺点：高效凝胶过滤，SDS还原电泳，SDS非还原电泳，ESI-MS,渗透压、超离心.第四节等电聚焦技术4.1Isoelectricfocusing(IEF):利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行分离分析的一项技术。1966年瑞典科学家Rilbe和他的学生Versterberg建立.是目前分辨率较高的一种电泳技术(0.001pH)适用样品为：蛋白质和其他两性分子4.2等电聚焦电泳的分类A.根据形成pH梯度的原理不同分类：人工pH梯度,载体两性电解质pH梯度，固相pH梯度B.根据支持介质分类:聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。C.根据电泳方式分类：垂直管式，毛细管式，水平板式，超薄水平板式。4.3常规PAGE与IEF的区别（原理）4.4等电聚焦的聚焦效应4.5载体两性电解质pH梯度等电聚焦定义:载体两性电解质是指一系列脂肪族多氨基多羧基的混合物。pI的分布在2.5-11.0之间,比较精密的等电点分布在3-4之间。载体两性电解质的特性：分子量小：Ampholine的分子量约为700，很少一部分1000可溶性好缓冲能力强导电性均匀紫外吸收低容易从聚焦的蛋白中除去无毒、无生物学效应pH梯度形成过程制备方法：配制丙烯酰胺溶液，把载体两性电解质溶液加入其中，不加缓冲溶液。4.6固相pH梯