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青霉素的培养基及其制备生化制药1005班第五组张俊伟郭蒙钦房青天赵世强邢孝林发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备提纲培养基的成分能源物质碳源物质氮源物质无机盐和微量元素前体物质促进剂和抑制剂水分淀粉水解糖的制备：酸解法、酶解法、酶酸结合法营养物质的调节不同碳源的利用速度氮源利用及与碳源利用的关系碳、氮比例的调节前体的控制补料培养基的类型第一节、培养基的成分培养基(Culturemedium)：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相当大的影响。培养基的营养成分及其功能1.碳源(Carbonsource)【糖类、脂肪、有机酸】：能源物质，构成菌体和代谢产物2.氮源(Nitrogensource)【无机氮源：氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠；有机氮源：豆饼粉、麦麸、玉米浆、蛋白胨；发酵菌丝体、酒糟】：构成菌体和代谢产物，硝化细菌的能源物质3.无机盐类(Mineralnutrition)【P、Mg、S、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co、Mn等】：维持酶活力，调节渗透压、pH值、电位等4.特殊生长因子【生物素、硫胺素、肌醇等】：构成辅酶的组成部分，促进生命活动5.水：溶解营养物质和代谢产物培养基的配置原则根据不同微生物的需要配置不同的培养基何菌种？何产物？是固态还是液态？是种子还是发酵培养基？1.各种营养物质的浓度与配比，特别是C/N2.将培养基的pH控制在一定范围内3.考虑利用价廉且易于获得的原料废代好、粗代精、野代家、烃代粮、纤代糖、国代进、简代繁青霉素生产1、斜面孢子、培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养条件：25℃、7d,注意湿度注意湿度50%左右培养条件：℃左右培养基特点：有利于长孢子，培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细大米孢子、培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养条件：℃培养条件：25℃、7d，控制湿度，培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表培养基的特点：成本低、面积和氧的传质，营养适当（面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。大米孢子的要求：粒米含粒米含1.4*106个孢子前体添加苯乙酸或苯乙酰胺，一次加入量不大前体添加苯乙酸或苯乙酰胺，一次加入量不大添加苯乙酸或苯乙酰胺于0.1%，以防止前体对青霉菌的毒害，以防止前体对青霉菌的毒害;加入的无机盐包括硫，钾等，加入的无机盐包括硫，磷，钙，镁，钾等，由于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控制铁于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控制铁离子浓度30g/ml.一、能源物质光能自养微生物：光能如：螺旋藻生产单细胞蛋白化能自养微生物：氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等无机物如：细菌炼铜异养微生物：碳水化合物、石油、天然气及石化产品二、碳源物质碳源物质是培养基主要成分；占细胞干物质的50％左右，提供能源、碳架、代谢产物。碳源物质的易利用顺序：葡萄糖（单）→蔗糖、麦芽糖、乳糖（双）→糊精→淀粉其他碳源物质：脂类、有机酸、石油等也能作碳源。糖蜜：蔗糖等的结晶母液，含糖50-70％，成分丰富，物美价廉。淀粉水解糖的制备糖化(Saccharify)：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等。水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖类等杂质越低越好。淀粉水解糖的制备酸解法反应原理：淀粉——————葡萄糖优点：设备单一、时间短（几分钟）缺点：对设备要求高（高温、高压、高腐蚀）副反应多，淀粉转化率低对原料要求高，淀粉颗粒大小均匀淀粉乳浓度不能太高酸（催化剂）高温高压StarchGlucose酶解法（双酶水解法）反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：对设备要求低，副反应少，产品纯度高，营养丰富对原料要求较低，淀粉乳浓度高缺点：所需设备较多反应时间较长（2-3天）淀粉酶糖化酶液化糖化淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备酶酸结合法之一，酸酶法反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：产品质量高，反应时间较短（2d）对原料要求较低，淀粉乳浓度较高用酸量少酸水解糖化酶淀粉水解糖的制备酶酸结合法之二，酶酸法反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：反应时间短（2hrs），产品质量较好对原料要求较低，淀粉乳浓度较高对淀粉颗粒大小无严格要求淀粉酶酸水解30min30min淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备几种水解方法的比较从时间上看：酸解法最快，酶解法最慢从原料转化率和糖液质量上看：酶解法酸酶法酶酸法酸解法三、氮源物质氮源物质是培养基的主要成分之一。提供菌体结构物质，能源（少），含氮代谢产物。有机氮源：豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵母粉、麦麸、鱼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素等。成分复杂，除含蛋白质、多肽、氨基酸外，还含糖、脂、无机盐、维生素及其他生长因子，对菌体生长非常有利。无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐被吸收、利用快，但成分单一，常作辅助氮源。四、无机盐和微量元素无机盐：酶的激活剂，生理活性物质的组成，生理活性作用的调节剂。主要包括：P、Mg、S、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co、Mn等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而高浓度有抑制作用。不同菌种、不同生长阶段需求量不同。小试常加P、K、S、Mg、Fe五、前体物质前体物质(Precursor)：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。抗生素(Antibiotin)发酵中常用的前体物质：抗生素前体物质青霉素Ｇ苯乙酸（或在发酵中生成苯乙酸的物质）链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐五、前体物质影响前体物质效力的因素菌种的特性与菌龄(Cellage)前体物质的投入量(Inoculationconcentration)前体物质的毒性(Toxicity)苯乙酸用量（％）青霉素产量（单位/ml)青霉素Ｇ比例（％）0.1７７５０57.30.2８５１５73.00.3９６３０90.60.4９２００95.6六、促进剂和抑制剂促进剂Accelerator（刺激剂Stimulant）并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。作用原理：改变细胞的渗透性，或“启动”微生物体内的生产部位，否则这些部位是被阻遏的，因此促进剂的添加可以大大提高产量。常用促进剂：各种表面活性剂Surfactant（洗涤剂、吐温80、EDTA、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等六、促进剂和抑制剂抑制剂(Inhibitor)的作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。抗生素生产中的抑制剂：抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖四环素金霉素溴化物、硫脲等头孢霉素C头孢霉素NL-蛋氨酸利福霉素B其它利福霉素巴比妥药物七、水分原生质的重要组分；优良溶剂；（物质进出细胞）维持大分子结构的稳定；参与生化反应；重要的物理性质：如：高比热；高汽化热；高沸点；冰的密度小于水等，保证生命活动的正常进行。其质量对产品质量影响很大。第二节、营养物质的调节培养基中各营养物的浓度和比例很严格。直接影响菌体的繁殖和产物的积累。尤其是碳氮比。（维持正常渗透压，节约原料也必需）1.不同碳源的利用速度2.氮源利用及碳源利用的关系3.碳氮比例的调节4.前体的控制5.补料一、不同碳源的利用速度不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。如：青霉素产生菌利用葡萄糖快（30-40小时），利用乳糖速度慢（6天）。一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快（淀粉最好）。快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。二、氮源利用及与碳源利用的关系不同氮源的利用速度也不同。如：铵盐比硝基氮更容易利用。氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。糖代谢中间产物是氨基酸的前体。氨浓度过高或过低，特别是过高，对某些产物（如：青霉素）的形成不利。三、碳氮比例的调节碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。一般情况：产物不含氮，细菌，100:0.2-2.0；酵母菌，100:20；霉菌，100:10。产物含氮，碳氮比较高。如：谷氨酸生产，100:15-21。四、前体的控制同前体对不同菌作用不同；不同前体对同种菌作用不同；同前体，同种菌，使用不同，效果不同。一般前体越多，增产越多；但大多毒性也增大。所以应该少量（0.05-0.1％），多次（1次/12小时）。同时要注意前体物质被作为营养物质利用。五、补料补料解决的问题：菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低，渗透压高。补料有利于：丰富培养基；产物合成旺盛期延长；控制PH和代谢方向；补足发酵液体积。补料的目的和方法：限制生长速度；仅维持呼吸，半饥饿状态，利于产物合成；控制好时间、速率和配比。谢谢观赏