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2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校1970年，有两位科学家做了一个人—鼠细胞融合实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。那么，如何实现人—鼠细胞的融合，以及动物细胞融合后还有什么用途呢？这就是今天我们这节课学习的内容。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校②动植物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？③植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、振动、电激等物理方法；PEG等化学方法动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中不须去除细胞壁和再生出细胞壁。①植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能，只能得到杂交细胞2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校⑤为什么要用灭活的病毒？病毒一般对生物体是有伤害的。⑥动物细胞融合有什么意义？突破了有性杂交方法的局限，使远源杂交成为可能。仙台病毒物理或化学方法丧失感染活性保留融合活性④动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能，还可以利用灭活的病毒（生物方法）进行诱导2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校细胞膜的流动性物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒也称细胞杂交，指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校灭活的病毒病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开,细胞发生融合。两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的动物细胞A诱导，融合杂种细胞AB有丝分裂（膜融合、质融合）（核融合）多核体动物细胞B注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校⑴意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。形成具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞⑵应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合过程原理细胞融合的过程诱导方法用途细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理、化学方法物理、化学、生物方法（灭活的病毒）获得杂种植株主要用于制备单克隆抗体细胞融合，植物组织培养细胞融合2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校1、什么是抗体？抗体是由何种细胞产生的？2、抗体是如何产生的？3、一个Ｂ淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校4、一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？用纯制的抗原多次接种于适当的成年健康动物，则激其产生免疫应答，血清中含有大量特异性抗体，又称抗血清或免疫血清。特异性差、纯度低、产量低、反应不够灵敏5、简述获得抗体的传统途径？这种方法获得的抗体有什么缺陷？2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校⑴B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生特异性抗体。⑵每一个Ｂ淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。⑶在体外，一个Ｂ淋巴细胞是不可能无限增殖的。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？提示1：仅用细胞培养技术可行吗？2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖杂种细胞动物细胞培养技术动物细胞融合单克隆抗体1、设计方案：（二）、单克隆抗体的制备1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验（在1984年获诺贝尔奖）2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校产生抗体无限增殖动物细胞培养利用B淋巴细胞的功能利用骨髓瘤细胞的特性利用技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用技术大量培养杂交瘤细胞动物细胞融合2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校阅读教材，思考下列问题：2.单克隆抗体制备过程诱导其融合的方法有哪些？融合后培养液中有几种细胞怎样筛选出杂交瘤细胞？杂交瘤细胞有何优点？注射抗原的目的是什么为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选？大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法是什么？2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤（一选）选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能存活获得产生相应抗体的B淋巴细胞注射抗原融合筛选的培养基克隆注射到小鼠腹腔体外培养（二选）（克隆化培养和抗体检测）：选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞选择培养杂交瘤细胞（B-瘤细胞）克隆化培养抗体检测杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔内增殖单克隆抗体第一次筛选第二次筛选经免疫的小鼠提取2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校细胞融合和动物细胞培养杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，即能迅速大量增殖，又能足够数量的特异性抗体。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校与常规抗体相比，单克隆抗体特异性强，灵敏度高，产量高，优越性十分明显。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校“生物导弹”＝抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素。②作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合。优点：准确、高效、简易、快速①在基础理论研究中具有重要意义③用于运载药物：制成“生物导弹”治疗疾病：主要用于癌症治疗2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校A1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.经过免疫的B淋巴细胞B.没经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校4、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的________________3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50注射到小鼠腹腔B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群AC没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞.不能。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。2012年下学期制作19湖南长郡卫星远程学校融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。