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细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作目录1.目的.......................................................................................................................................22.范围.......................................................................................................................................23.引言、定义和缩略语...........................................................................................................24.程序.......................................................................................................................................24.1细胞培养的基本操作.........................................................................................................24.2细胞复苏.............................................................................................................................34.3培养.....................................................................................................................................34.4细胞株冻存.........................................................................................................................44.5防护.....................................................................................................................................55.登记和归档...........................................................................................................................55.1登记.....................................................................................................................................55.2归档.....................................................................................................................................56.职责.......................................................................................................................................57.培训.......................................................................................................................................5细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作1.目的本条SOP的目的是规范在体外哺乳动物染色体畸变和基因突变试验的CHL和L5178Y细胞株的冻存、复苏、培养及其相关基本操作规程。2.范围本条SOP适用于所有进行该项操作的人员。3.引言、定义和缩略语细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。4.程序4.1细胞培养的基本操作4.1.1细胞计数体外哺乳动物细胞染色体畸变或基因突变试验中，都需要采用血球计数板进行细胞计数并且该计数结果记录在相应的原始记录中。4.1.2细胞清洗4.1.2.1贴壁细胞的清洗贴壁细胞的清洗是吸出细胞培养物中的原有培养基，加入适当体积（覆盖细胞表层）的Hank`s缓冲液清洗，吸出Hank`s缓冲液。4.1.2.2悬浮细胞的清洗悬浮细胞的清洗过程是1000rpm/min离心细胞培养物5-10mins，弃上清，加入适当体积的Hank`s缓冲液，重悬细胞，1000rpm/min离心5-10mins，弃上清。4.1.3贴壁细胞的消化吸出原有细胞培养液，使用Hank`s清洗细胞1-3次，加入适量的0.25%胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞层直到细胞层发生分散（通常用时5-15分钟），加入含有血清的全培养液，轻轻吹打制备细胞悬液。备注：在观察细胞消化的过程中，为了避免细胞团块的凝集，不要用力摇晃细胞瓶。当细胞较难消化时，可将细胞放置在37°C条件下加速消化分离的过细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作程。4.2细胞复苏首先将细胞培养基放置在37℃条件预热半小时以上。将液氮中取出冻存有CHL或L5178Y细胞株的冻存管迅速放置在37℃水浴锅中。为了避免可能产生的污染，避免将冻存管口处放置在水浴锅的水浴中，复苏过程需要快速进行（约3分钟）。当肉眼观察管中内容物完全融化后，需要尽快将冻存管从水浴锅中取出。喷洒75%酒精灭菌。1000rpm/min离心5-10mins。弃上清，加入0.5-1ml培养基重悬细胞，将该细胞悬液转移至含有3-5ml培养基的细胞瓶中并放置在37℃，5%CO2的湿润条件下进行培养。复苏的全部过程避免剧烈的震摇。复苏的相关过程需要记录在相关的记录中。4.3培养4.3.1培养条件悬浮细胞L5178Y和贴壁细胞CHL的需要在37℃，5%CO2的湿润的条件下进行培养。细胞培养基应当选择完全培养基。4.3.2培养细胞复苏后在倒置显微镜下观察细胞，当细胞融合度超过60%时，则需要传代，相关过程应当记录在相应的记录中。4.3.3换液CHL细胞的培养过程中需要每周更换新的细胞培养基1-3次。L5178Y细胞的培养过程中需要每3-4天更换一次细胞培养液。换液的过程需要记录相关的记录中。4.3.4传代4.3.4.1CHL细胞传代消化细胞制备细胞悬液，根据稀释比例和试验需要，将等比例的细胞悬液分别加入新的细胞培养瓶中，并加入适量的细胞培养基进行细胞培养，并记录相关的记录中。4.3.4.2L5178Y细胞传代细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作轻轻吹打细胞制备悬液，根据稀释比例和试验需要，分别将适当比例的细胞悬液加入到新的培养瓶中，并加入适量的细胞培养基进行细胞培养，并记录相关的记录。备注：细胞培养基中的血清比例可以根据细胞生长状态在5%-20%范围进行调整。传代的比例（稀释比例）建议在1:3到1:10之间。.4.4细胞株冻存4.4.1细胞冻存液1）配方应用成分含量(1ml)CHL二甲基亚砜100µl胎牛血清900µlL5178Y二甲基亚砜100µl马血清900µl2）配制方法：根据以上配方配制相应的细胞冻存液。细胞冻存液需要现用现配。4.4.2CHL和L5178Y的冻存当培养的CHL细胞融合度大于60%时即可进行细胞冻存。弃去细胞培养液，使用Hank`s清洗细胞1-2次，消化细胞，制备细胞悬液，细胞悬液1000rpm/min离心5分钟，弃上清，加入所需冻存液，重悬细胞，将制备的细胞悬液转移至新的冻存管中并在冻存管上标记细胞名称，代数，序列号，制备日期，操作者。使用脱脂棉包裹细胞冻存管。将细胞冻存管放置于超低温冰箱中冻存24-48小时，再将该冻存管转移至液氮中冻存。细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作当培养的L5178Y细胞融合度大于60%时即可进行细胞冻存，细胞悬液1000rpm/min离心5分钟，弃上清，使用Hank`s缓冲液清洗细胞1-2次，加入1-2ml细胞冻存液，重悬细胞，将细胞悬液转移至新的冻存管中并在冻存管上标记细胞名称，代数，序列号，制备日期，操作者。使用脱脂棉包裹细胞冻存管。将细胞冻存管放置于超低温冰箱中冻存24-48小时，再将该冻存管转移至液氮中冻存。备注：如果冻存的多管具有相同名称及代数的细胞，则标记序列号。例如：有三管冻存的CHL细胞并且是相同的代数，则如下标记：CHL-细胞代数-①制备日期操作者CHL-细胞代数-②制备日期操作者CHL-细胞代数-③制备日期操作者冻存中需要记录相关的记录。4.5防护在所有的操作中需要进行全面的防护措施。操作者需要穿戴工作服，防护眼镜，手套，口罩和帽子。当操作完成后，需要彻底的清洁工作区域。5.登记和归档5.1登记·所有的操作者需要按规定记录有关事项。5.2归档·实验室负责人负责年初相关的记录的统一归档。6.职责操作者职责：·按规程要求操作，并记录相关事项。复核者职责：·对记录信息进行核对并签字确认。7.培训项目负责人：细胞株的复苏、培养、冻存及其基本操作·阅读本条SOP；试验操作者：·阅读本条SOP；·在正确的指导下，练习规范操作，至少2次。