慢病毒载体构建及包装操作手册

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1.汉恒生物慢病毒质粒列表附2.慢病毒滴度测定方法简介附3.慢病毒MOI感染参数附4.汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。3)操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。6)实验完毕用香皂清洗双手。➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。2)慢病毒的稀释汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2,pMD2.G,pHBLVTM系列质粒。1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。3、菌株：大肠杆菌菌株DH5α用于扩增辅助包装载体质粒；Stbl3用于扩增pHBLVTM系列质粒，防止病毒载体重组。三、慢病毒包装和浓缩(一)质粒扩增汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1g/l，A260/280在1.7-1.8间方可用以病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。(二)做脂质体转染转染前一天，按照5106/T75的密度铺下293T细胞。24h后转染。转染前请把DMEM和转染试剂LipoFiterTM恢复至室温，使用前需摇匀。转染每瓶T75的质粒成分如下：psPAX210μgPMD2.G10μgpHBLVTM系列载体10μg请参考LipoFiterTM转染试剂说明书进行转染操作。转染后6h换新鲜培养基。注：LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物研制的DNA转染试剂产品，使用说明请参考LipoFiterTM说明书。(三)病毒收集和离心转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45μm滤器过滤,于40ml超速离心管中，4℃，72000g离心120min。(四)病毒重悬和保存500l新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃甚至液氮保存。四、感染目的细胞汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册(一)细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。(二)病毒感染1.Polybrene的选择：Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对Polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合Polybrene需要摸索；不同细胞对Polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，Polybrene最常用的工作浓度为6～8μg/ml。注：1）汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进行辅助感染。提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。2）Polybrene预实验请先使用对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene的使用范围请参见附表3。2.感染细胞最佳MOI的测定MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。3.感染步骤按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃培养过夜。对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加0.5mlPolybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24孔板，其他孔板请相应调整体积。）注：对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。感染前，从冰箱取出并在冰上慢慢融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入细胞中，轻轻混匀。（具体加入的病毒数可参考附表1）37℃小体积感染4h，4h后补齐培养基至正常体积。（感染时培养基体积表格如下）病毒小培养体积感染表培养皿类型表面积/cm2培养基体积病毒体积96-well0.3cm2100µl50µl24-well2cm2500µl250µl12-well4cm21ml500µl6-well10cm22ml1ml慢病毒感染4h后补足至培养体积，感染24h后换液，腺病毒感染4-8h后直接换液汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册感染后第二天（约24h），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。感染后48h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。注意：融化的病毒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。4.Puromycin抗性筛选Puromycin标准的施加终浓度范围为1～10μg/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的Puromycin。部分细胞Puromycin参考值：CelllineSpeciesPuromycin(µg/ml)293系列Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册MCF-7Human1-3MDA-MB-×××Human1-3HepG2Human2HT1080Human1A549Human1.5H1299Human2Humanembroyonicstemcells（HumanESCs）Human1更多Puromycin使用浓度更新中，详情请参考公司网站的完全培养液，直至没有感染病毒的对照组细胞被Puromycin杀光，然后可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）。1)不挑取单克隆将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。连续筛选并传3代后，冻存保种细胞Mixture（这种Mixture由于各个细胞的不均一性，有时候表型可能不是太好，建议做单克隆挑取）。2)挑取单克隆将感染并筛选后的细胞挑选至少5个克隆进行细胞扩增，并继续施加Puromycin进行维持性筛选培养。扩增完毕后Westernblot或者qPCR检测目的蛋白或基因的表达。挑取表达量适中的稳定细胞株，连续筛选并传3代后，冻存保重稳定细胞株。汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册5.感染悬浮细胞感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后，封好口，放入平角离心机后，低速（200g）离心1h，然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，室温放置15min（尽量不要超过30min），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。6.对于极难感染的细胞对于极难感染的细胞，如DC（树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24h后，更换新鲜病毒进行二次感染，可显著提升感染效率。7.传代能力较差的原代细胞对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册附1：汉恒生物慢病毒质粒列表（质粒图谱请登陆汉恒官网查询）载体名称用途启动子容量抗药标记荧光标记pHBLv-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-puro过表达CMV2.5kbPuromycinRFPpHBLv-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro过表达CMV2.5kbPuromycinZsGreenpHBLV-CMV-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro过表达CMV2.0kbPuromycinLucpHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro过表达CMV3.0kbPuromycin无pHBLV-CMV-MCS-T2A-Puro过表达CMV3.0kbPuromycin无pHBLV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen过表达CMV3.0kb无ZsGreenpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro过表达CMV3.0kbPuromycinRFPpCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro过表达CMV2.5kbPuromycinGFPpHBLV-Tet-on-SV40-puroTet-on过表达TRE3G1.5kbPuromycin无pHBLV-CMV-crRNA-EF1-GFP-T2A-puro环状RNA过表达CMV2.5kb无GFPpHBLV-U6-MCS-EF1-mCherry-干扰U6shRNPuromycinmCherry汉恒慢病毒载体构建及包装操作手册T2A-puroApHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro干扰U6shRNAPuromycinZsGreenpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro干扰U6shRNAPuromycinLucpHBLV-U6-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-Luc干扰U6shRNA无ZsGreen/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-RFP-T2A-Luc干扰U6shRNA无RFP/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Bla干扰U6shRNABlasticidinLucpHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen干扰U6shRNA无ZsGreenpHBLV-U6-MCS-PGK-puro干扰U6shRNAPuromycin无pHBLV-EF1-cas9-U6-gRNA-puroCas9/gRNAE