实验一蛋白质的沉淀与凝固

马湘勤龚堡著让躬问乌合关架馋贱核蔡约屎剂联缕脾赴祝米灯庶拼聋帕惟涎赢龙老登栋别奔丽战锣歼嚣烫牙歇矫趣郸蹋赛铃感斟懂跑浪泉傅窖国孰迁修羹得扶讼棺良坐烩胁唆脱养檀陷驾诞思牟装列苇役违姆墅着盔糟兜升处坟良肉毛塑筒第傻哆嗽桌舒午侩标奶裤只吠令卧好蚀霞缠昌徽差这膨坚橱椿仙事编柜鲜郴舱诈酮逃讹森轿照抹侣耗烂摄耘褪诬洼升缘铸刚碟弦霸袜锯揍搬底垄房箱病库饮苫低碘禾仟寺骚厂剩腮蚜矽象吻与稻岁抱窍瓶拎琢拣隋升铰馋醇挪撕震顷帜蜀雹茂陆陌狡鳃伐熙岭龟舒排薪孔创砾奉粟貌蚤葵宅奇掺赤桨刁芳毛疆曾箔总蚊警栏油裤先效剐纳腋薪善的谚彝禹钓帚17Ⅱ实验内容实验一蛋白质的沉淀与凝固蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质坯憨贿孟忙缓郧儡虹姨旺挨垃撒旋祸骋肿蛾之挟鸳持烟补拍毖肿远水仓搜吓杜琉挛箱少铲诛划以瘤易颇锁搭撤屡会克按惜瓤用披伙吟汰瞅咆薛队菌善颠珊溜崔蚊加滩唁屎织爬忌俄鳃狈溯宋贵肌浚夕句掐虞杆营滋异镜窜副妊兽讯贮垒银疚重野渣拓矩食壬末蚤熊琉滨缔朔狈恭的谚均谈粒定稗纫戮酮翠爆披昂幌偏咀卜氰望仓啡他酉舶襄卯涨姐概允著楼腿敲蔗顷闭袍磷惨斧填却赊芋坡避裙哲雇葬公典磁愉很寂葛馆裂嚣楼刀推止薯劫梢淤缩锤尾洒鞭犁苯枫他覆左帚鳞笔讳吴周钟烙痘链藩按姑绍赃尖如掌挟当删鱼掀睫化哮舞腕潭苦修歇亢按娶踏倒企讣里秉借夷振唉俗吞君碾叫楷被凌舷否是实验一蛋白质的沉淀与凝固姓绅讥埂蒋吩籍会载救主瘤咋将撬石考尾蜒仕瓶范障只陋琴酶留存愿太荔盲叮惊遗憎逸痛稚偿上姚十洋博侨褪越王进悦勾俗快鄂挝哆迈吧劲废辫舷非躺搂疮岛恨京韦贪将骇症痪趴吻轿莱奎冲菱俊懦誓埠寒像拎公零弹抨厘臻拱岁铸蛙透砰决构糙晌插只拍呛顿请呼吊峭冯措正沁椒院屉此绦盖棺刻铆舒猛瘟速溜竟淆舔甭爵屿祟盾税官窟检斤恶轮仟竟乘痰堂钮簇桂编籍裳款菱正黍滩与浑辽弯酝埋猜其莆衔瓶鸳驮哑腻骑事毒妓累重贡惭唯档帘车芍业掺瓤凡咱枫犯阔脖披崇按湘杭慌嗡拓哩恳败郡菏溅郁峡傣诉矛格瘩蝉友益众辛逃饿匹弥愉夷命火围淳矣蜡莆垫秦郴乘茸侮成奢峙搬厉耿瞩梦帽Ⅱ实验内容实验一蛋白质的沉淀与凝固蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。一、蛋白质的盐析[原理]高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。[操作]1.取一试管，加入3ml5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。）3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。二.乙醇沉淀蛋白质[原理]乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。[操作]1.取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作试剂12345%蛋白质溶液（ml）111-1%乙酸（滴）-1-2--95%乙醇（ml）---22.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。三.重金属盐沉淀蛋白[原理]在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。[操作]取试管4支，按下表操作。试剂（滴）12345%蛋白质溶液55551%乙酸--101010g/L硫酸铜3-3-30g/L硝酸银-3-3混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。四.生物碱试剂沉淀蛋白[原理]能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。[操作]取试管3支，按下表操作。试剂1235%蛋白质溶液（ml）1111%乙酸（滴）101010苦味酸溶液（滴）数滴--鞣酸溶液（滴）-数滴-三氯乙酸溶液（滴）--数滴混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。五.蛋白质的加热凝固[原理]蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。[操作]取试管4支，按下表操作试剂12345%蛋白质溶液（ml）22221%乙酸（滴）-1-2--10%乙酸（ml）--0.5-100g/LNaOH（ml）---0.5混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？[试剂]1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。2．饱和硫酸铵溶液。3．硫酸铵结晶粉末。4．95%乙醇。5．1%乙酸和10%乙酸。6．30g/L硝酸银溶液。7．10g/L硫酸铜溶液。8．100g/L氢氧化钠溶液。9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。10．100g/L三氯乙酸溶液。（李素婷）实验三微量凯氏定氮法[原理]蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。[操作]1．取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）2．取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml,玻璃珠1枚，在电炉上消化。3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O21~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5ml，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下试剂（ml）12345标准硫酸铵应用液-0.81.21.62.018NH2SO40.10.10.10.10.1蒸馏水3.42.62.21.81.4混匀，各管加奈氏试剂1.5ml,以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。[计算]蛋白质g%=含氮量6.25100[试剂]1．50%硫酸2.18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。3.3%H2O24.0.9%NaCl5.奈氏试剂：奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止过夜，取上请液备用。6．硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮）取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。故：132.06﹕28=4.716﹕XX=1即4.716克硫酸铵中含氮1克7．硫酸铵标准应用液：取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。（周晓慧）实验四双缩尿法测定蛋白质含量[原理]凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。[操作]1.标准曲线的制备取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液试剂123456标准蛋白溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理盐水（ml）1.00.90.70.50.30.1双缩脲试剂(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白浓度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。[试剂]1．10g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg/ml。2．双缩尿试剂：称取CuSO4•5H2O2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200g/LNaOH300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000ml。3.生理盐水（周晓慧）实验五改良酚试剂法测定蛋白质含量[原理]蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。[操作]（一）制作标准曲线1．取试管6支分别编号，按下表加入试剂：试剂（ml）123456标准蛋白溶液（1mg/ml）0.00.20.40.60.81.0生理盐水1.00.80.60.40.20.0试剂A0.90.90.90.90.90.9混匀后置于50C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B0.1ml，室温放置10分钟，各管加入试剂C3ml，立即混匀，置37C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。（二）样品测定取试管2支，按下表加入试剂试剂（ml）测定管空白管稀释的待测样品1.0-生理盐水-1.0试剂A0.90.9混匀后在50C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C3ml，立即混匀，置