9616S_rDNA鉴定细菌的方法

16SrDNA鉴定细菌的方法细菌16SrDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。6.BLAST比对获取相似片段。7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。1.21MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)（1L）：121.1gTris，加浓盐酸约（70ml,60ml,42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与xml0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.30.5MEDTA（pH8.0）（1L）：186.1gNa2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。(配置方法1.称取186.1gNa2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。3.用NaOH调节pH值值8.0（约20gNaOH）。注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5.适量分成小份后，高温高压灭菌。6.室温保存。）1.410×TEBuffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100mMTris-HCl，10mMEDTA。1MTris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5MEDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TEBuffer用10×TEBuffer稀释10倍即可。1.510%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。6、5MNaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7MNaCl）：溶解4.1gNaCl，加10gCTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA。浓储存液50×：242gTris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)。11、6×上样缓冲液（100ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)（0.2ml），4℃保存。12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50ml。13、EB：10mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20mg/ml溶于水，-20℃保存，反应浓度50ug/ml，反应缓冲液：0.01mol/LTris(pH7.8),0.005mol/LEDTA,5%SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。15、RNaseA：10mg/ml。25mgRNaseA加1MTris（pH7.5）25ul，2.5MNaCl15ul，无菌水2460ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备破碎细胞或胞膜—内容物释放核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。1快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。2蛋白酶/SDS法制备用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE（50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次。将菌体充分悬浮在5ml1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。（取上清液。乙醇沉淀DNA。用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。3细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。细菌收集：取1ml培养物于1.5mlEP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mlTE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。菌体裂解：加入6μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）。抽提：菌液均分到两个1.5mlEP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10。洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。抽（凉）干后，溶于50μlddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。5CTAB/NaCl裂解法接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25mlLB培养基中，37℃、200r/min培养24h。取1.5ml菌液于1.5mlEppendorf离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。加入1.5mlTE离心洗涤后,用567ulTE溶解菌体,混匀。加入30μl10%SDS和3ul20mg/ml的蛋白酶K（100ug/ml），混匀，于37℃温育1h。加入100μl5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。用50ul双蒸水溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA,每孔点样6μl(4μl样品+2μlloadingbuffer),80V,电泳1.5小时。2.设计选择引物进行16SrDNA的PCR扩增一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2.1实验原理2.1.1PCR多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。PCR（PolymeraseChainReaction)的原理2.1.216SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。其序列包含10个可变区（variableregion）和与之相同的11个恒定区（constantregion），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。2.1.3PCR法的操作过程Step1:DNA热变性；Step2:引物退火；Step3:引物延伸2.2PCR反应标准体系DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶2.2.1PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。dNTP:反应体系中达100μM～200μM。Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。2.2.2材料设备及试剂设备：eppendorf管、微量取液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪试剂：16SrDNA引物、细菌基因组DNA、TaqPlus、dNTP、PCR、冲液、琼脂糖、TAE电极缓冲液、LamdarDNA/HindⅢ、染色液、加样缓冲液2.2.3操作步骤PCR反应依次混匀下列试剂5μl10×PCR反应缓冲液1μl4种dNTP2μl上游引物（引物１）2μl下游引物（引物２）1μl模板DNA0.5μlTaqDNA聚合酶38.5μlH2O混匀后离心5秒。扩增：用94℃变性3分钟，94℃变性1分钟，61℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后,于72℃下最