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抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的不同浓度配制药物原液，其浓度需比纸片浓度大200倍，如青霉素G的纸片为10U/片，青霉素G的原液浓度为2000U/mL，200张纸片内即加入1mL青霉素G原液。药液浓度见下表。纸片内抗菌药物含量2.3纸片浸润、干燥、保存用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml（含药量按表所列计算，例如，庆大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml），加入摊布于灭菌平皿中的100片纸片中，置冰箱内浸泡1~2小时，必要时可不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，如立即实验可不烘干，若保存备用可用下列一种方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。A．培养皿烘干法将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2~3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。B．真空抽干法将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥器了，用真空抽气机抽干。纸片的保存将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中置冰箱内保存备用。（纸片不应长期保存于常开的普通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器中。）收到纸片后应立即保存在-20~4℃中，由于实验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完的放回冰箱中。3.细菌的制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。下表为麦氏比浊管制法：4.接种平板制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。5.粘贴药敏试纸待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。纸片间距离不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。直径为90mm的平板最好贴6张。贴好纸片后，需在15min内置35℃培养箱内培养。培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养18～24h后，读取结果。四、结果判定培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。五．实验结果多黏菌素9.61低敏诺氟沙星23.58高敏泰乐菌素23.63高敏六、结果分析与讨论1.抗菌药物敏感性试验方法－纸片扩散法药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。抗菌药物敏感性试验方法很多，常见有纸片扩散法，稀释法，E试验。本实验中采用纸片扩散法，操作简便，所需器材简单。通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。2.实验中大肠杆菌的耐药情况大肠杆菌对24种抗菌药物的敏感性如上表所示。从表中可以看出，大肠杆菌对多粘菌素的敏感性较低外，对诺氟沙星、新霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素等5种抗菌药物抗菌药物都显示很高的敏感性。由此可见，实验中所采用的大肠杆菌还未产生明显的耐药性。该株大肠杆菌对多粘菌素的敏感性明显降低，说明其耐药性有上升趋势，应注重平时抗生素的合理使用。3.实验中抗生素的主要作用诺氟沙星具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，对肠杆菌科的大部分细菌在体外具良好抗菌作用，体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。新霉素对葡萄球菌、棒状杆菌属有良好作用，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属等肠杆菌科细菌亦有良好作用，对各组链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属等活性差，铜绿假单胞菌、厌氧菌等对本品耐药。链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对该品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。氟苯尼考对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等均有作用。泰乐菌素在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌、肺炎双球菌、丹毒杆菌、副嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、巴氏杆菌、螺旋体、球虫等病原体引起的各种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红霉素和泰妙菌素。种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红霉素和泰妙菌素。4.控制细菌耐药性的主要对策[3~6]4.1普及相关医疗知识，合理使用抗菌药物细菌耐药性的出现主要是在临床上滥用抗生素的结果。特别是在畜禽养殖业中，基层人员缺乏相关的知识，认为只要加大剂量、延长疗程使用就一定能控制疾病，而全然不考虑药物的残留和耐药性的产生。因此，应加强基层医务人员的相关医疗知识，用药时要严格掌握适应症、适当的剂量和疗程，既要避免剂量过大造成的药物浪费和毒性反应的出现，又要注意剂量不足而导致疾病的复发及耐药性的产生。严格掌握抗菌药物的局部用药、预防用药和联合用药，避免滥用。在控制动物疾病时尽量减少抗菌药物的使用，最好的方法是改善动物的饲养条件，防止疾病发生。4.2加强药政管理严格控制抗菌药物的审批、生产标准，加强抗菌药物的质量监督，控制抗菌药物的使用管理。4.3研制和开发新的药物根据细菌耐药性的发生机制及其与抗菌药物结构的关系，寻找和研制具有抗菌活性，尤其对耐药菌有活性的新抗菌药；同时可以针对某些因细菌灭活酶而失效的抗菌药物，寻找适当的酶抑制剂，与抗菌药物联合应用时可保护药物不受灭活酶的破坏而保存其抗菌活性。4.4开发不使用抗菌药来治疗感染的治疗策略药敏试验方法（Kirby-Bauer法）：1、试验材料：（1）培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂，该培养基具有对大多数细菌生长良好、不拮抗药物活性以及商品批间差小等优点。配制方法见培养基配制。（2）药物纸片：直径为6.00～6.35mm,每片吸水量约20μl。（3）质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。测定M—H琼脂是否适合做磺胺类试验须用粪链球菌ATCC29212或33186，上述菌株可向卫生部或省临床检验中心购买。质控菌株保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M—H平板复活，然后每株细菌接种10支高层琼脂，放冰箱保存，每月取1支，传种细菌供常规使用，待用至最后1支再传代在M—H平板上接种一批高层琼脂备用。（4）菌液比浊管：为保证药敏试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制，采用比浊法来控制菌悬液浓度，接种浓度1.5×108ml，浊度相当于麦氏标准管第一号的1/2，比浊管配制方法如下：0.048mol/LBaCl20.5ml和0.18mol/LH2SO499.5ml，将两液混合，置螺口试管中或普通试管玻璃纸加塞后，再用石蜡封住，放室温保存。用前混匀。有效期6个月。（相当于1/2号比浊管）2、操作方法：（1）制备接种菌液：挑临床标本中分纯的菌落4～5个于M—H液体培养基中，置35℃水浴箱孵育4小时，校正浊度。或用接种环挑取菌落悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。（2）接种平板：用无菌的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压去掉多余的菌液，用棉拭子涂布整个培养基表面，反复三次，每次将平板旋转60度，最后沿平板边缘绕两圈。（3）贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊子尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平板边缘不少于15mm，直径为90mm的平板，贴纸片7张，贴好纸片后，须在15min内放培养箱，不可放CO2环境中。（4）孵育：采用35℃，平板在孵箱内单独摆放，孵育18～24hr后，读取结果。（5）判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘，抑菌环直径判断细菌的敏感性应依据《全国临床检验操作规程》提供的解释标准。3、应遵守的准则：（1）备用纸片应储存在-20℃冰箱保存。无低温冰箱时，放冰隔内保存。（2）工作用纸片储存冰箱中，不超过一个月。（3）M—H琼脂必须符合试验要求。（4）培养基的酸碱度以pH7.2～7.4最适宜。（5）校正接种菌液浓度与标准比浊管相同，即达0.5号麦氏管浊度。（6）抑菌环大小是以测量抑菌环直径为标准来解释，每次试验时，质控菌种的抑菌环应完全符合所规定的范围。优缺点