实验三葡聚糖凝胶柱层析

实验三、葡聚糖凝胶柱层析1、目的与要求：1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。2、凝胶层析法的原理：凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。这样就可使大小不同的分子分开。Vt(totalvolume)Vo(outervolume)Vi(innervolume)Ve(elutionvolume)Vg(gelvolume)Vt（床体积）=Vo+Vi+Vg,Ve（洗脱体积）=Vo+Kd×Vi。介绍几个体积：Kd是分配系数：用于衡量物质在凝胶内外的分配率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi几个特征Kd值意义：①Kd=0,则Ve=Vo，全排阻；②Kd=1,则Ve=Vo+Vi,全掺入；③0＜Kd1,则Ve=Vo+Kd×Vi，部分掺入；④Kd1，则VeVo+Vi，Sephadex对它们有吸附作用。如某些芳香族化合物（Phe,Tyr,Trp等），2.1、影响凝胶层析分离的因素：1、样品的体积、粘度；2、层析柱；（高度，内径，材质）3、洗脱液流速的影响过慢：扩散过快：拖尾4、洗脱液离子强度、PH的影响。2.1.1、样品的体积、粘度：分析分离时：Vsample=1-4%Vbed；制备分离时：Vsample=25-30%Vbed.分离体积(Vsep):相邻两组分Ve之差，用于衡量相邻两组分的分离效果。Vsep=Ve1-Ve2，当VsampleVsep时，则相邻两组分可完全分离。相对粘度：样品液粘度与洗脱液粘度的比值。分离效果只与相对粘度有关，一般来说，相对粘度不得超过1.5―2。今天的上样量（0.2ml）约为1%柱床体积。2.1.2、层析柱：①柱长：组别分离时，5－30厘米；分级分离时，可长至100厘米；②柱径：分析分离时，由于样品量少，常使用1厘米直径的层析柱，若制备分离时样品量大，最好使用直径2－3厘米的层析柱。今天选用的是1cm×30cm的层析柱。2.1.3、洗脱液的离子强度和pH值的影响：多糖类，水是最佳洗脱剂；蛋白类,离子强度＞0.02M的盐溶液作洗脱剂，以消除凝胶的吸附作用；PH＞7时，酸性物质易被洗脱；PH＜7时，碱性物质易被洗脱。2.2、凝胶层析法的应用：1、分子量的测定用已知分子量的标准蛋白洗脱制备标准曲线。2、分离多组分混合物3、脱盐与分离纯化用于脱盐的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶。此时，溶液中大分子（如蛋白质）的kd=0，盐类的kd=1，易于分离脱盐。如:用于去除热原物质热源是微生物产生的某些可以使人发热的物质，多为内毒素，是制药中必须去除的物质。内毒素是一个含脂肪A、糖类和蛋白，是带负电的复合大分子。内毒素经常是多聚体，凝胶过滤层析可有效地将之去除，特别是在小分子药物。选用的凝胶可以与脱盐类似，只是此时热源等大分子物质的kd=0，而小分子药物的kd=13、凝胶介绍：凝胶是一种具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）吸收大量液体（水或洗脱液）溶胀而成。3.1、层析用凝胶必须具备下列条件：1、惰性：保证其不与待分离物质发生化学反应；2、稳定；3、低电荷：避免离子交换效应的发生；4、足够的机械强度：在一定的操作压下不形变。3.2、能用于层析的凝胶主要有下面几种：2.2.1、天然凝胶：马铃薯淀粉凝胶、琼脂及琼脂糖凝胶。2.2.2、人工合成凝胶：聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶。交联葡聚糖凝胶：是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构凝胶过滤介质名称分离范围颗粒大小（μm）特性/应用pH稳定性工作干凝胶溶胀体积mL/g溶胀最少平衡时间h最快流速(cm/h)室温沸水SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25CoarseSephadexG-25MediumSephadexG-25FineSephadexG-25SuperfineSephadexG-50CoarseSephadexG-50MediumSephadexG-50FineSephadexG-50SuperfineSephadexG-75SephadexG-75SuperfineSephadexG-100SephadexG-100SuperfineSephadexG-150SephadexG-150SuperfineSephadexG-200SephadexG-200Superfine70015001000~50001000~50001000~50001000~50001500~300001500~300001500~300001500~300003000~800003000~700004000~1.5×1054000~1×1055000~3×1055000~1.5×1055000~6×1055000~2.5×105干粉40~120干粉40~120干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40干粉40~120干粉10~40脱盐及交换缓冲液用脱盐及交换缓冲液用脱盐及交换缓冲液用脱盐及交换缓冲液用小分子蛋白质分离小分子蛋白质分离小分子蛋白质分离小分子蛋白质分离中等蛋白质分离中等蛋白质分离中等蛋白质分离中等蛋白质分离稍大蛋白质分离稍大蛋白质分离较大蛋白质分离较大蛋白质分离2~132~132~132~132~132~132~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~102~32.5~3.54~64~64~64~69~119~119~119~1112~1512~1515~2015~2020~3018~2230~4020~253366666666242448487272727211222222223355552~52~52~52~52~52~52~52~52~52~572164711215.6112.8SephadexLH20(嗜脂性)100~4000干粉25~106特别为使用有机溶剂而设计。适合分离脂类、胆固醇、脂肪酸、激素、维生素及其他小生物分子。此分离范围指以酒精为溶剂的分离同一型号的胶，胶颗粒越细，所形成的柱子理论踏板数越高，分辨率越高，这也就是为什么很小的HPLC预装柱能够有很好的分离效果的原因了。凝胶过滤层析介质的技术数据凝胶过滤介质名称分离范围颗粒大小μm特性/应用pH稳定性工作耐压Mpa最快流速cm/hSuperdex30Superdex75Superdex200Superose6Superose12SephacrylS-100HRSephacrylS-200HRSephacrylS-300HRSephacrylS-400HRSepharose6FastFlowSepharose4FastFlowSepharose2BSepharose4BSepharose6BSepharoseCL-2BSepharoseCL-4BSepharoseCL-6B100003000~7000010000~6000005000~5×1061000~3000001000~1000005000~25000010000~1.5×10620000~8×10610000~4×10660000~20×10670000~40×10660000~20×10610000~4×10670000~40×10660000~20×10510000~4×10624~4424~4424~4420~4020~4025~7525~7525~7525~75平均90平均9060~20045~16545~16560~20045~16545~165肽类、寡糖、小蛋白等重组蛋白、细胞色素单抗、大蛋白蛋白、肽类、多糖、核酸蛋白、肽类、寡糖、多糖肽类、小蛋白蛋白，如清蛋白蛋白、抗体多糖、具延伸结构的大分子如蛋白多糖、脂质体巨大分子巨大分子如重组乙型肝炎表面抗原蛋白、大分子复合物、病毒、不对称分子如核酸和多糖（蛋白多糖）蛋白、多糖蛋白、多糖蛋白、大分子复合物、病毒、不对称分子如核酸和多糖（蛋白多糖）蛋白、多糖蛋白、多糖3~123~123~123~123~123~113~113~113~112~122~124~94~94~93~133~130.30.30.30.40.70.20.20.20.20.10.10.0040.0080.020.0050.0120.02100100100303020~3920~3920~3920~393002501011.5141526303.3、葡聚糖凝胶Sephadex）的使用原则2.4.1、型号选择：组别分离时，SephadexG－25最为常用。例如样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐；分级分离时（如多种蛋白质的分离），应根据待分离物中各组分的分子量大小和分子量分布范围来确定型号。参考商家的产品信息。2.4.2、粒度的选择：组别分离时，选用较粗的颗粒；分级分离时，以细颗粒凝胶为主，而且要求颗粒大小均匀。同型号的胶，同样的床体积，粒度小的胶对样品的分离度要优于粒度大的胶，即有较高的分辨率。3.4、凝胶的防腐、保存：Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质，易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中加入抑菌剂，使用时再除去。1.常用0.02％叠氮钠作防腐剂。该溶液在1厘米光程时，254nm处透光率为60％，280nm处透光率为100％。2.现多用20％的乙醇溶液保存各类凝胶3.5试剂、器材：3.1层析介质SephadexG-50；3.2混合样品（由三个组分组成）（要过滤或离心）：蓝葡聚糖2000－10mg/ml，溶菌酶—40mg/ml,Trp—10mg/ml。上样量：0.2ml/柱。3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水（需抽滤）3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。4、实验操作过程：4.1、凝胶用量的计算；4.2、凝胶的溶胀；4.3、装柱；4.4、上样；4.5、洗脱和收集。4.1、凝胶用量的计算：根据层析柱的容积和所选凝胶溶胀后的柱床体积计算出所需凝胶干粉的重量。凝胶的克数＝Vbed÷Vc。凝胶过滤介质名称分离范围颗粒大小（μm）特性/应用pH稳定性工作干凝胶溶胀体积mL/g溶胀最少平衡时间h最快流速(cm/h)室温沸水SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25CoarseSephadexG-25MediumSephadexG-25FineSephadexG-25SuperfineSephadexG-50CoarseSephadexG-50MediumSephadexG-50FineSephadexG-50SuperfineSephadexG-75SephadexG-75SuperfineSephadexG-100SephadexG-100SuperfineSephadexG-150SephadexG-150SuperfineSephadexG-200SephadexG-200Superfine70015001000~50001000~50001000~50001000~50001500~300001500~300001500~300001500~300003000~800003000~700004000~1.5×1054000~1×1055000~3×1055000~1.5×1055000~6×1055000~2.5×105干粉40~120干粉40~120干粉100~300干粉50~150干粉20~80干粉10~40干粉100~300干粉50~150