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实验三细菌的单染色与革兰氏染色法微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。1微生物染色的基本原理细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带正电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。2染色方法微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。实验三细菌的革兰氏染色法一、目的要求1学习掌握革兰氏染色法。2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理三、器材1菌种大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。2溶液和试剂革兰氏染色液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，番红复染液3仪器或用具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、无菌生理盐水、载玻片夹子、滤纸四、操作步骤1制片涂片：固体培养物，液体培养物。注意事项：载玻片要洁净无油迹；滴加生理盐水和取菌不宜过多；涂片均匀，不宜过厚。干燥：室温自然干燥。固定：涂面朝上，通过火焰2－3次。热固定温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜。A.加小滴水B.涂成薄层C.固定菌体革兰氏染色–制片2初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）,染色1－2min，水洗。3媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜约1min，水洗。4脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般液20－30S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。5复染用番红液复染约2min，水洗。革兰氏染色–染色6镜检干燥后，用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。7混合涂片染色将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。ProceduresofGramStainingGrampositiveorGramnegative?实验报告1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球菌的染色结果。2．思考题思考题1.现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌株是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？2.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？3.革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？