CRISPR-Cas9技术原理

CRISPR/Cas9概述技术原理：CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR/Cas系统的高效基因编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(guideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor)，它能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何dsDNA序列，而RNA可连接到gRNA的末端，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。CRISPR/Cas9技术特点：1）可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除；2）可对基因进行定点修饰（Tag、GFP、RFP、点突、条件性敲除），效率高。3）实验周期短，价格低；4）可应用于大、小鼠等，无物种限制。