吉大豆5号子叶节遗传转化体系的优化及GmPEPC4基因的功能分析

吉大豆5号子叶节遗传转化体系的优化及GmPEPC4基因的功能分析大豆是世界上主要的油料作物之一,高油品种选育一直是大豆育种者的重要工作内容。但油分含量是由多基因控制的数量性状,遗传稳定需多个世代,传统品种选育方法育种周期长,工作量大。利用基因工程手段可以定向获得遗传稳定的转基因品系,可提高育种效率。PEPC基因是植物中光合作用的关键酶。前人研究证明,PEPC基因作为中枢碳代谢途径中的关键节点,表达量与油脂含量相关,可将代谢流导向三羧酸循环,使碳通量向非脂积累方向流动,不易油脂积累。干扰该基因的表达可增加油分含量。本研究克隆了GmPEPC4基因,构建RNAi载体,拟在高油大豆品种吉大豆5号中沉默GmPEPC4基因,以期进一步提高大豆的油份含量。同时优化了吉大豆5号的遗传转化体系,为大豆品种选育提供技术支持。结果如下:1.本研究以大豆Williams82为材料,利用PCR法克隆了大豆GmPEPC4基因,成功构建过表达载体3300-PEPC4和1301-PEPC4、RNA干扰载体PFGC-PEPC4i。2.转化大豆毛状根、分子鉴定得到转基因的阳性材料,检测该外源基因对根的油脂及脂肪酸含量的影响。索氏提取结果显示,沉默GmPEPC4基因的大豆毛状根粗脂肪含量提高0.97%,过表达GmPEPC4基因的毛状根中粗脂肪含量提高了0.19%,但均未到达显著水平。GC-MS分析结果表明从大豆新鲜毛状根中分离得到5种主要脂肪酸,其中转基因GmPEPC4基因导致大豆毛状根粗脂肪含量略有上升,但未达到显著水平。脂肪酸含量鉴定,沉默GmPEPC4基因,油酸、亚油酸含量显著上升,其中亚油酸上升达到极显著水平。过表达GmPEPC4基因,亚油酸下降达到了极显著水平。3.优化后吉大豆5号子叶节遗传转化体系,选择75%酒精30s,无菌水洗4-5次,10%次氯酸钠浸泡20min,无菌水洗大豆种子4-5次;萌发1天;侵染浓度OD600为0.6;共培养阶段添加二硫苏糖醇200mg/L和硫代硫酸钠250mg/L来降低褐化率;抑菌剂浓度为头孢霉素150mg/L,特美丁200mg/L;芽诱导阶段basta筛选最佳浓度为10mg/L;芽伸长期添加玉米素与吲哚乙酸最佳浓度1.5mg/L和0.2mg/L,赤霉素1.0mg/L。