方法学考察PPT-1.6

1中药质量标准方法学验证主讲人：孙启慧1.中药质量标准方法学验证的意义？2.中药质量标准方法学验证的主要内容及方法？23方法学验证的目的Ⅰ方法学验证：是对测定方法的评价,是建立新方法的研究内容和依据。Ⅱ证明采用的方法是否适合于相应的检测方法或分析要求；Ⅲ新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更等均须验证。4需验证的分析方法类型鉴别（薄层鉴别）限量检查（重金属含量限度检查）含量测定溶出度、释放度残留物（农药残留）、添加物（食品添加剂）等的限度检查5需验证的分析方法内容检查验证项目鉴别定量限度含量测定准确度-+-+重复性-+-+中间精密度-+①-+①精密度重现性②++++专属性③++++检测限--+-定量限-+--线性-+-+耐用性++++范围-+-+①已有重现性验证，不需验证中间精密度。②重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。③如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。专属性线性检测限、定量限精密度（重复性、中间精密度、重现性）稳定性准确性（回收率）耐用性67专属性（Specificity）专属性定义:专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。鉴别：确证被测物是否符合其特性；检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等；含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果。8专属性常用的试验方法空白阴性对照试验比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的一致性9专属性空白阴性对照试验的试验要求：TLC：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分相应的斑点。HPLC/GC/TLCS：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保留时间相应的位置应无色谱峰或其峰面积小于5%胃灵颗粒质量标准研究—专属性10图芍药苷含量测定HPLC色谱图a芍药苷对照品；b供试品；c白芍阴性对照品；1.芍药苷11线性关系考察（Linearity）线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度（质量）直接呈正比关系的程度。12线性试验方法：制备梯度浓度对照品溶液，以相同体积进样测定峰面积值，制备标准曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方程和相关系数；制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积进样测定，同法处理；线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，一般使待测成分峰面积处于标准曲线的中间浓度左右为宜；计算相关系数，要求：TLCS：R＞0.99，HPLC-UV：R＞0.999，HPLC-ELSD：R＞0.99513胃灵颗粒质量标准研究—线性关系考察：进样量（μg）0.15150.3030.6060.9091.212峰面积134.9269.3539.4809.91080.4表芍药苷线性范围图芍药苷标准曲线14范围：范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围。验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次数等。15拓展1：检测限检测限指供试品中被测物能被检出的最低量试验方法采用已知浓度的对照品进行试验直观法如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后目测观察，可检出的最小量为检测限。仪器法（信噪比法）用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。16拓展2：定量限（LimitofQuantitative,LOQ）定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。试验方法：一般以10倍于噪音的对照品溶液重复点样或进样5-6次，计算重复点样或进样的峰面积值的RSD%。当RSD%＜3%（薄层扫描法）或＜2%（高效液相色谱法/气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定量限。若RSD%较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定注：中药不需要做定量限，定量限属于有关物质方法学中的一项，主要是考察仪器能检测的该品种的最小浓度。17精密度（Precision）精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀标准品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度(离散程度)精密度包括一下三方面：重复性(Repeatability)中间精密度(Intermediateprecision)重现性(Reproducibility)精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品进行研究。18重复性(Repeatability)重复性:在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度。19重复性实验要求：在规定范围内，取样品6份，按供试品制备方法，平行制备6份供试品进样分析，对测定结果进行评价；或设3个不同浓度9份样品，用9个测定结果进行评价（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平均浓度，计算9份样品的相对标准偏差）20重复性测定数据的精度要求一般应满足以下规定相对标准偏差(RSD%)TLCS＜5%，HPLC/GC＜3%。21中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响考察的因素:不同时间、不同分析人员、不同设备至少3人采用同一设备或同一人采用3台不同设备，对同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的含量平均值和相对标准偏差。有重现性考察的，可以免做中间精密度。22胃灵颗粒质量标准研究—中间精密度：人员123RSD%A573.6589.3578.5580.5±8.031.38B564.1559.9567.2563.7±3.660.65C582.2569.8574.9575.6±6.231.08取批号为20130910的胃灵颗粒粉末9份，每份1g，由不同人员按供试品溶液的制备方法分别制备供试品，每人制备3份，分别进样20μl，测定峰面积，结果表明方法中间精密度良好，结果见下表。表芍药苷中间精密度试验SX23重现性在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果之间的精密度。考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据，报送两个实验室之间的相对标准偏差。稳定性考察原料药或者药物制剂在温度，湿度，光线等影响下随时间变化规律的试验方法。一般稳定性是取0h、2h、4h、8h、12h，等各个时间点的供试品进样，是为了考察样品在室温情况下的稳定程度。24胃灵颗粒质量标准研究—稳定性：25编号0h2h4h8h12hRSD%峰面积589.5590.6581.8573.3563.4579.7±11.471.98SX表8芍药苷稳定性试验26准确度(Accuracy)系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，有时也称真实度，一般用回收率(%)表示，用于定量的分析方法均需做准确度验证。以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂等）27试验方法：同一样品，制备相同浓度的6份样品（样品取样量减半，以1：1比例加入对照品）同一样品，制备3个浓度的供试品，每个浓度分别制备3份供试液，共9份，对照品的加入有以下3种方式：28取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计3个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1：1比例加入，低、高浓度可选0.5：1、1.5：1的比例。加入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。取3个不同量的样品各3份，每个取样量分别按1︰1比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范围考察的最高、最低点进行测定。按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9份样品，按0.8：1、1：1、1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）。报告的数据：样品中待测成分含有量对照品加入量测定量回收率计算值（%）相对标准偏差（RSD%）29测定数据的精度要求一般应满足以下规定回收率（%）95～105％相对标准偏差（RSD%）TLCS＜5%，HPLC/GC＜3%30胃灵颗粒质量标准研究—加样回收试验：31编号取样量(g)样品中芍药苷含量(μg)对照品添加量(μg)测定量(μg)回收率(%)RSD%10.5014155.9121.2275.698.73101.15±2.072.0520.5001155.8121.2279.9102.6030.5105156.2121.2284.8103.9640.5198156.2151.5316.0101.8650.5078156.4151.5315.6104.1160.5156157.2151.5310.398.9670.5163156.2181.8343.6100.6780.5224156.2181.8343.299.4290.5044157.0181.8338.7100.02SX取1g白芍含量为0.3110mg·g-1的胃灵颗粒（批号20130910）粉末9份，分别加入芍药苷101μg·ml-1的对照品1.2ml、1.5ml和1.8ml。按照供试品溶液的制备方法分别制成低、中、高三个浓度的供试品各3份，依法进行含量测定，计算加样回收率和RSD。结果见下表。耐用性指测定条件微小的变动，测定结果不受其影响的承受程度。变动因素包括，样品溶液的稳定性，提取次数，时间，流动相比例，柱温，进样口温度，流速，检测波长等。3233举例：流动相比例、柱温、流速等实验条件的变动均能通过本试验系统适用性试验要求，表明该方法耐用性良好。验证结果要求如下：1.专属性实验（制剂）：以不含被测成分的供试品试验，其含量测定数值应小于同样条件下供试品测定数值的5%。2.精密度实验：相对标准偏差（RSD%）应小于3%。3.稳定性实验：相对标准偏差（RSD%）应小于3%。4.准确度实验：其回收率的测定结果应在95%～105%范围内，其中对于一些前处理较复杂的方法，其回收率的测定结果可在90%～110%范围内；准确度实验的相对标准偏差（RSD%）应小于5%。34方法学考察中需要注意的几点中药不需要做定量限，做个线性关系考察（至少五个点）和加样回收率（三个浓度，每个浓度平行三份）即可；稳定性考察不属于精密度，他们是不同的考察项目。中药单味药材没法做专属性考察，中药复方才能做专属性考察。35含量测定研究常见问题药味的选择问题：一般不应选择水解产物如苷元等作指标；供试品溶液制备考察不全面：如提取方法、提取溶媒、提取时间等；对照品溶液浓度与供试品不匹配；标准曲线的制备（标准曲线不过原点）、样品测定不在线性范围之内取样、范围太小、单位等问题3637含量测定研究常见问题含量测定低于万分之一含量测定限度结果的表示不合理色谱条件的选择应详述理由并附相关图谱方法改变后应与原方法作比较对照品溶液的制备对照品称量难以达到精密称定的要求回收率测定问题38规范实验记录的原则原始性实验过程中的内容应一一记录，特别是没有写入申报资料中的内容真实性按照实验的步骤如实记录逻辑性记录数据与申报资料要对应，不应有缺项、漏项，不应有不符合逻辑的事项规范性按要求如实记录，如水分、pH等项目到底应记录哪些数据参考文献：[1]中国药典[2]张永峰,姬雪礼,张泽,等.止咳化痰片质量标准研究[J],食品与药品,2013,4(15).[3]胡煊红.茯苓多糖提取工艺及质量控制研究[D].西南交通大学硕士学位论文,2012年.[4]孙佰兴.注射用熊胆粉含量测定方法学研究[D].延边大学硕士学位