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技术支持：010-59822661/2665订货电话：010-59822688产品简介产品简介产品简介产品简介：：：：本试剂盒采用碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附DNA。以下操作步骤适用于提取1-5ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。提取得率提取得率提取得率提取得率：质粒类型菌液量得率质粒低拷贝1-5ml3-12ugpBR322,pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体，SuperCos,pWE15高拷贝1-5ml6-30ugpTZ，pUC,pBS,pGM-T注意事项注意事项注意事项注意事项：：：：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。。。。1．溶液P1在使用前先加入RNaseA（（（（将试剂盒中提供的将试剂盒中提供的将试剂盒中提供的将试剂盒中提供的RNaseA全部加入全部加入全部加入全部加入）））），混匀，置于2–8℃保存。2．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。3．使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。4．注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。5．所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000rpm(~13,400×g)。6．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。7．实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。8．用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。9．去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤：：：：1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（（（（吸附柱放入收集管中吸附柱放入收集管中吸附柱放入收集管中吸附柱放入收集管中））））加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（（（（请使用当天处理过的柱子请使用当天处理过的柱子请使用当天处理过的柱子请使用当天处理过的柱子））））2.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌液较多时可以通过多次离心将菌液较多时可以通过多次离心将菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中菌体沉淀收集到一个离心管中菌体沉淀收集到一个离心管中菌体沉淀收集到一个离心管中）。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（（（（请先检查是否已加入请先检查是否已加入请先检查是否已加入请先检查是否已加入RNaseA）））），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意注意注意注意：：：：如果有未彻底混匀的菌块如果有未彻底混匀的菌块如果有未彻底混匀的菌块如果有未彻底混匀的菌块，，，，会影响裂解会影响裂解会影响裂解会影响裂解，，，，导致提取量和纯度偏低导致提取量和纯度偏低导致提取量和纯度偏低导致提取量和纯度偏低。。。。4.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。注意注意注意注意：：：：温和地混合温和地混合温和地混合温和地混合，，，，不要剧烈震荡不要剧烈震荡不要剧烈震荡不要剧烈震荡，，，，以免以免以免以免打断打断打断打断基因组基因组基因组基因组DNA，，，，造成提取的质粒造成提取的质粒造成提取的质粒造成提取的质粒中混有基因组中混有基因组中混有基因组中混有基因组DNA片断片断片断片断。。。。此时菌液应变得清亮粘稠此时菌液应变得清亮粘稠此时菌液应变得清亮粘稠此时菌液应变得清亮粘稠，，，，所用时间不应超过所用时间不应超过所用时间不应超过所用时间不应超过5分分分分钟钟钟钟，，，，以免质粒受到破坏以免质粒受到破坏以免质粒受到破坏以免质粒受到破坏。。。。如果未变得清亮如果未变得清亮如果未变得清亮如果未变得清亮，，，，可能由于菌体过多可能由于菌体过多可能由于菌体过多可能由于菌体过多，，，，裂解不彻底裂解不彻底裂解不彻底裂解不彻底，，，，应减少菌体量应减少菌体量应减少菌体量应减少菌体量。。。。5.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意注意注意注意：：：：P3加入后应立即混合加入后应立即混合加入后应立即混合加入后应立即混合，，，，避避避避免产生局部沉淀免产生局部沉淀免产生局部沉淀免产生局部沉淀。。。。如果上清中还有微小白色如果上清中还有微小白色如果上清中还有微小白色如果上清中还有微小白色沉淀沉淀沉淀沉淀，，，，可再次离心后取上清可再次离心后取上清可再次离心后取上清可再次离心后取上清。。。。6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（（（（吸附柱放入收集管吸附柱放入收集管吸附柱放入收集管吸附柱放入收集管中中中中）））），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7.可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(~13,400×g)离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.Order:010-59822688Technical:010-59822661/2665Toll-free:800-990-60578.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW（（（（请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇）））），12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。10.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意注意注意注意：：：：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（（（（酶切酶切酶切酶切、、、、PCR等等等等））））实验实验实验实验。。。。为为为为确保下游实验不受残留乙醇的影响确保下游实验不受残留乙醇的影响确保下游实验不受残留乙醇的影响确保下游实验不受残留乙醇的影响，，，，建议建议建议建议将吸附柱将吸附柱将吸附柱将吸附柱CP3开盖开盖开盖开盖，，，，置于置于置于置于室温室温室温室温放置放置放置放置数分钟数分钟数分钟数分钟，，，，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。。。。11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的向吸附膜的向吸附膜的向吸附膜的中间中间中间中间部位滴加部位滴加部位滴加部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。注意注意注意注意：：：：洗脱液的洗脱液的洗脱液的洗脱液的pH值值值值对于洗脱效率有很大影响对于洗脱效率有很大影响对于洗脱效率有很大影响对于洗脱效率有很大影响。。。。若用水做洗脱液若用水做洗脱液若用水做洗脱液若用水做洗脱液，，，，应保证其应保证其应保证其应保证其pH值值值值在在在在7.0-8.5范围内范围内范围内范围内(可以用可以用可以用可以用NaOH将水的将水的将水的将水的pH值调到此范围值调到此范围值调到此范围值调到此范围)，，，，pH值低于值低于值低于值低于7.0会降低洗脱效率会降低洗脱效率会降低洗脱效率会降低洗脱效率。。。。洗脱缓洗脱缓洗脱缓洗脱缓冲液体积不应少于冲液体积不应少于冲液体积不应少于冲液体积不应少于50μl，，，，体积过小影响回收效率体积过小影响回收效率体积过小影响回收效率体积过小影响回收效率。。。。且且且且DNA产物应保产物应保产物应保产物应保存在存在存在存在-20℃℃℃℃，，，，以防以防以防以防DNA降解降解降解降解。。。。低拷贝或大质粒低拷贝或大质粒低拷贝或大质粒低拷贝或大质粒（（（（10kb））））提取提取提取提取如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5-10ml过夜培养物，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在65－70℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间在吸附和洗脱时可以适当的延长时间在吸附和洗脱时可以适当的延长时间在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，，，，以增加提取效率以增加提取效率以增加提取效率以增加提取效率。。。。其它步骤相同。TIANprepMiniPlasmidKit质粒小提试剂盒质粒小提试剂盒质粒小提试剂盒质粒小提试剂盒（（（（离心柱型离心柱型离心柱型离心柱型））））目录号目录号目录号目录号：：：：DP103试剂盒内容试剂盒内容试剂盒内容试剂盒内容：：：：试剂盒组成试剂盒组成试剂盒组成试剂盒组成DP103-02(50次次次次)DP103-03(200次次次次)RNaseA(10mg/ml)150μl600μl平衡液BL30ml120ml溶液P115ml60ml溶液P215ml60ml溶液P320ml80ml去蛋白液PD30ml120ml漂洗液PW15ml50ml洗脱缓冲液EB15ml30ml吸附柱CP350个200个收集管(2ml)50个200个说明书1份1份储存条件储存条件储存条件储存条件：：：：本试剂盒在室温(15-25℃)干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2-8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNaseA在室温可稳定保存1年以上。加入RNaseA后的溶液P1应置于2–8℃保存，可稳定保存半年。本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。版本号版本号版本号版本号:PP080822