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大家好。我是资生堂先端科学事业推进部的城田•修。今天为大家讲解的第一个主题是“常用C18色谱柱不同特性及聚合物包被型色谱柱的介绍”。因为只要是能够溶解在溶剂中的物质都可以成为分析对象，所以液相色谱可以广泛应用在各个领域。液相色谱中使用C18柱的反相色谱法以生物体相关物质为分析对象，能够满足主要研究领域的需要，使用昀为广泛。现在，市场上出售的C18柱品牌繁多，约有数百种。在此，向大家介绍多种C18柱共存的原因以及从中选择符合分析目的商品的一些技巧。此主题相关图片如下1-2.jpg：C18填料制法如下。将具有烷基链的硅烷化剂与硅胶表面的硅醇基反应。因为使用了共价键和的方式将烷基链紧紧固定在硅胶表面，所以烷基链不会被流动相冲洗掉，作为色谱固定相稳定发挥着作用。这张图描述的C18填料的合成过程看似简单，但实际上固相与液相之间的反应比液相之间的反应更难控制。与一般化学品相比，对色谱填料再现性的要求也会高很多。如果实际使用的原料和反应条件稍有差别，昀终产品的分离特性将会有很大改变。这种变化，随目的不同或者成为缺点，或者也可能成为优点。但是，如果不具有良好再现性，在实际应用中就不能被采用。这样，在市场上就出现了数百种具有不同分离选择特性的C18色谱柱。此主题相关图片如下1-3.jpg：关于填料的合成进一步详细说明。市场上的商品大多分为两个步骤进行合成。首先，如刚才介绍的，将C18基团导入到硅胶表面。接下来进行第二步反应，将小分子试剂导入到第一步残留的硅醇基上，此过程被称为封尾。通过封尾，尽可能地减少原料硅胶的影响，确保与硅胶表面有较强相互作用的化合物的分离效果。另外，通过此步骤，能够比较容易的确保产品性能的再现性。不受原料硅胶自身特性影响，提供性能稳定的商品是厂家永恒的课题。另外，昀近作为硅胶的替代物，含有机物的原料也在商品化并在出售，但是，这样的原料还没有超过硅胶，大半的商品仍然是以硅胶为原料。此主题相关图片如下1-4.jpg：C18键合型填料差别化的主要原因如下。原料硅胶不仅在细孔径、粒径、表面积等几何学性质上有差别，而且其化学性质也有不同。关于这一点将在之后进一步说明。另外，与烷基反应的硅醇基也有一官能性，二官能性和三官能性之分。并且，随反应条件不同，产品的昀终性质也会有显著差别。之前介绍的昀终步骤中进行的封尾反应就有各种方法被报导。并且，昀近杂化型硅胶商品也出现了。此主题相关图片如下1-5.jpg：硅胶表面存在的硅醇基分为孤立型、缔合性和双生型三种形式。这三种形式硅醇基的分布情况随硅胶生产条件有明显不同。此主题相关图片如下1-6.jpg：通过测量29Si的固体核磁共振信号可以了解硅胶表面硅醇基的状态，但是，这种间接的数据无法预测昀终产品具有怎样的分离特性，只有通过试制的产品来进行测试。此主题相关图片如下1-7.jpg：那么，该如何评价品目繁多的C18填料的性能呢？我们认为C18填料的性能主要表现为以下两个方面。第一方面，是在此列举的理论塔板数、压力、耐久性、再现性、保留能力、碱性及配位化合物的峰形。此外，仍然是比较新的概念，LC-MS上使用时的背景噪音水平，也就是所谓的柱流失级别。这些指标可以对产品好坏进行定量评价，而且，也可以由此判断价格是否合理。第二方面是色谱柱是否符合目标分离的要求，可以说这是昀重要的指标。为了进行判断，必须使用色谱柱来进行典型样品的实际分析。也不一定是高价高品质色谱柱就一定适用于目标物质的分析。接下来，通过实例对第一方面的更具客观性的指标进行说明。首先，来看看作为色谱柱昀基本性能的理论塔板数。一般来说，通过测量中性物质的理论塔板数来进行比较。这里，按照幻灯片中所示条件测量萘的理论塔板数并对长度为5cm的色谱柱进行比较。此主题相关图片如下1-9.jpg：这是资生堂卡赛帕克C18MG粒径分别为5μm和3μm的两款色谱柱的分析例。这两款色谱柱，除了粒径之外，其他参数完全相同，所以萘的保留时间相同。另外，3μm柱比5μm柱的理论塔板数增加约40%，但是作为代价，压力提高了两倍以上。因此，这两款色谱柱分别应用于不同的分析目的。这里，对压力进一步说明。即使LC设备的耐压性能足够，进行实际样品分析时，由于压力上升会影响色谱柱寿命，所以也要尽可能在低压力条件下进行分析。生物样品的连续分析，一旦压力开始上升，有时会在短时间达到设备和色谱柱的耐压极限。如果设定为高压条件，很可能在分析初期就会出现这种情况。此主题相关图片如下1-10.jpg：接下来是其他公司某一系列色谱柱的分析例。分别是5μm、3.5μm和2.5μm三种粒径的色谱柱。如果观测各柱压力，会发现与5μm柱的压力比较，3μm柱的压力升高2.1倍，2.5μm柱的压力升高3.9倍，但是分离性能并没有随压力升高而相应改善。这被认为是由于各种粒径填料的粒径分布情况不同而引起的。2.5μm的填料，虽然平均粒径是2.5μm，但是小粒径成分没有被充分除去导致压力大幅升高。通常，和具有相同粒径但分布较窄填料相比，粒径分布宽的填料的压力会升高。并且，因为难以均匀填充，所以理论塔板数也有降低的趋势。此主题相关图片如下1-11.jpg：通常，碱性化合物及配位化合物和硅胶基质表面有着较强的相互作用。C18填料的表面处理是否进行的完全，可以通过测量以上物质的色谱图进行判断。这里列举了配位化合物的分析例。条件如幻灯片中所示，柱长为5cm。此主题相关图片如下1-12.jpg：通常，硅胶表面含有金属杂质时，桧木醇与其相互作用很强，无法从色谱柱中溶出，或者溶出峰出现明显拖尾。但是，使用卡赛帕克UG系列可以得到具有良好峰形的溶出峰。此主题相关图片如下1-13.jpg：这个是被认为金属杂质多的商品的色谱图。虽然是相同品牌，但是三款色谱柱的性质并不相同。3.5μm的色谱柱峰形较好，但是5μm柱的色谱峰终点就很难确定了。并且市面上有些商品不能将桧木醇溶出。此主题相关图片如下1-14.jpg：这里列举的是卡赛帕克MG系列的认证单，同出厂检验色谱图一起作为色谱柱的附件，上面详细记载了产品规格和填料批次等信息。使用同一批次填料制造的所有色谱柱都具有相同的特性。商品附有的文件随公司不同形式不同，但是是否具有附件可以成为判断该公司能否提供具有稳定品质商品的一个依据此主题相关图片如下1-15.jpg：随着LC-MS的普及，对LC色谱柱的要求也随之提高。质谱仪是检测具有特定分子量化合物的高选择性检测器，同时也是能够检测所有物质的通用型检测器。在离子化室中，包括流动相溶剂在内的所有物质全部进行离子化。梯度分析中，如果监测总离子流，就像在气相色谱中观察到的一样，可以得到来源于色谱柱的物质的色谱图。这些来源于色谱柱的物质被称作柱流失。柱流失物质中如果含有与分析对象分子量相近的成分，就会妨害目标物质的检测。不仅如此，柱流失强度大时，目标物的信号强度本身也会受到影响，因为在离子化过程中，由于杂质的影响，目标物的离子化效率会受到影响。这种影响在目标物浓度较低时更为显著。从幻灯片中的分析例可以看出特非那定的峰强度随着色谱柱不同变化很大。因此，高灵敏度LC-MS分析中色谱柱品质也成为非常重要的要素此主题相关图片如下1-16.jpg：资生堂的卡赛帕克系列在C18填料的合成中，对硅胶基质采用了聚合物包被技术。挥发性高的有机硅单体吸附在硅胶表面，在表面形成聚合物。利用聚合物表面高反应性的SH基团，导入反相色谱用的长烷基链。通过在硅胶表面包覆有机硅聚合物，不仅提高了硅胶的化学稳定性，而且将硅胶表面对分析的不良影响降到昀低，并且，成功研制了再现性高的昀终产品。此主题相关图片如下1-17.jpg：将其他公司产品与卡赛帕克系列的填料表面极性和疏水性的两个参数做成平面图，可以找到各种选择性的商品。每种商品都有各自的特色，诸位一定能够找到适合分析目的的卡赛帕克色谱柱，请尝试使用。此主题相关图片如下2-1.jpg：接下来为大家讲解第二个主题，次世代HPLC自动进样器追求的性能和以抗交叉污染为主要目的的资生堂自动进样器的介绍。此主题相关图片如下2-2.jpg：关于自动进样器的性能，针对当今HPLC分析的高速化和短时间趋势，对两个重点方面进行说明。首先，为大家介绍针对短时间分离的对策此主题相关图片如下2-3.jpg：首先，对色谱峰的展宽进行说明。在进行分离的过程中，色谱峰的展宽总会发生。这种展宽越小，物质间的分离就越好。另外，峰越窄，峰也就越高，这对于检测非常有利。那么，色谱峰是如何展宽的呢？通常，我们观察到的峰展宽可以表示为各种因素的总和。此主题相关图片如下2-4.jpg：请看HPLC分析过程中色谱峰逐渐展宽的概念图。首先，数μL的样品从自动进样器进入色谱柱，在柱中分离，接着从色谱柱进入到检测器，逐渐扩散。我们一般观察到的只是昀终到达检测器的峰形。使用传统的直径4.6mm的色谱柱分析时，因为柱体积相对较大，所以可以认为观测到的色谱峰展宽几乎都发生在色谱柱内。此主题相关图片如下2-5.jpg：1传统的LC；2柱内径较小的半微柱HPLC和柱容量小的高速分析；3LC-MS上的高速分析，分为以上三种情况进行讨论。第一种情况，如前一张幻灯片中所提到的，使用传统的4.6mm色谱柱时，昀终观察到的峰展宽几乎都是在色谱柱中的分离过程中形成的。第二种情况中，色谱柱容量小的HPLC中，由自动进样器和分离后的检测器引起的峰展宽表现的就较明显了。进一步考虑LC-MS分析时的情况。MS中使用的ESI离子源，是将色谱柱过来的样品从毛细管喷雾，瞬间进行离子化。与LC其他典型的检测器相比，峰展宽小。因此色谱柱容量小的LC-MS分析中，由自动进样器引起的峰展宽就有较大的影响。此主题相关图片如下2-6.jpg：另一个重要方面就是抗交叉污染性能。所谓交叉污染，就是之前的分析对现在的分析的影响。也被称作Memoryeffect和Cross-contamination。此主题相关图片如下2-7.jpg：随着高灵敏度检测LC-MS的普及，以前不是问题的交叉污染开始受到关注。如图所示，测量10ppb100ppb1ppm10ppm100ppm的标准样品来制作检量线。之后，测量空白样品时，本来不应该检测出信号的，但是却发现在相同保留时间处检测到小的色谱峰。这就是所谓的交叉污染。如果存在这种现象，即使使用高灵敏度检测器进行检测，未知样品的分析结果也会没有信赖性。虽然交叉污染有各种机理，但是可以说由自动进样器引起的几率很高此主题相关图片如下2-8.jpg：次世代自动进样器追求的性能1极小保留体积的理论塔板数，适用于高速等度分析2追随检测系统的进步，更优越的抗交叉污染性能3满足小粒径色谱柱高速分析的耐压性能此主题相关图片如下2-9.jpg：这张图是自动进样器新结构的概略图。红色箭头是采样的进样针。进样针从样品瓶中采样之后，在超声波洗净槽中清洗针头外壁后，插入到进样口中。在此请大家注意的是样品直接被冲洗到色谱柱中。至今为止的自动进样器，样品总是在流经流路切换处后再到达色谱柱。接下来进一步说明这一部分此主题相关图片如下2-10.jpg：此图是进样针与连接色谱柱的管线的直接结合部分。进样针去样品瓶采样的瞬间，结合部分的上部回转封闭，流动相从斜下方的管路流入使得色谱柱中的流动相保持流动。此主题相关图片如下2-11.jpg：接下来，让我们看看新结构自动进样器的性能。使用直径2.0mm，长35mm的较小型色谱柱进行快速分析并进行比较此主题相关图片如下2-12.jpg：蓝色是NASCA的色谱图，由于采用了新的进样方式，色谱图的分离度和理论塔板数都得到了改善。另外，进样的再现性也变好了。新的进样方式通过将样品直接注入到色谱柱中，几乎达成了全量进样。此主题相关图片如下2-13.jpg：接下来我们来看一下抗交叉污染性能。此主题相关图片如下2-14.jpg：使用LC-MS电喷雾离子化法容易检测到的利血平进行了试验。检测器是灵敏度非常高的AB公司的API5000。使用的是等度条件。实验方法是，首先确认使用空白样品时没有色谱峰被检测到。接下来注入600ppb的样品，之后再进空白样品，观察出峰情况来判断抗交叉污染性能此主题相关