艾滋病检测技术新进展

艾滋病检测技术新进展及其应用郭志宏浙江省疾病预防控制中心内容提要1.HIV急性期感染或窗口期感染检测（Ab/Ag联合检测和集合PCR）2.婴幼儿早期诊断（nestRT-PCR）3.快速检测策略及质控1、HIV-1持续流行：全球HIV流行和AIDS仍继续增加，尤其是MSM同性恋人群，多达50%HIV传播发生在疾病急性和早期，（流行病学意义）2、高病毒RNA水平：性传播感染仍具首位，生殖道HIVRNA水平相当于血液中HIVRNA水平。高病毒载量、独特的病毒特性以及缺乏中和抗体，急性期感染者感染性极高。VL10Mcopies/mm33、极易垂直传播：怀孕妇女感染HIV非常常见，增加HIV垂直传播的危险。2011年4月全国报告的HIV感染者（5560例）中，母婴传播占1.3%；AIDS病人（2806例）中，母婴传播占1.0%。公共卫生意义：HIV-1流行形势严峻为什么HIV急性感染（AHI）越来越受到重视？4、应尽早尽快进行诊断：HIV感染急性期，感染者无症状和流感样症状而经常漏检而误诊，感染者本人不知自己感染状态，极易在高危人群中传播5、应尽早进行人群干预：实时对感染者及其配偶、孕妇感染者及其婴儿进行干预，知晓感染状态，减少危险性行为；了解和干预复杂的性传播网6、应尽早进行病毒干预：在AHI时期进行可能的干预以限制HIV复制和整合入病毒潜伏池、（整合后不可治愈），早期抗病毒治疗的必要性(转变观念)7、指导疫苗研究：基于急性期感染时期的传播性/奠基者病毒的特性8、建立人类自然模型：研究AHI个体，为详细了解人类HIV传播事件提供最好的机会公共卫生意义：早诊断、早干预、早治疗、降两率、指导疫苗研究为什么HIV急性感染（AHI）越来越受到重视？•方法：前瞻性随访高危人群队列发现阳转感染者（MSM,IDU,SW,单阳伴侣）•限制：1）前瞻性随访HIV阴性人群的巨额花费；2）在阳转时刻或接近阳转时难以找到研究对象，难以采集到急性期血清阴性病毒血症期峰值的样本；（美国国防部联手NIH已经启动疫苗免疫性队列研究RV217，每周二次检测HIVRNA，试图发现AHI；我国十一五重大专项也启动了急性期感染的研究）前瞻性队列研究：高危人群横断面研究：普通人群•血液中心通常使用集合（6-96份血浆）NAT筛查，阳性集合拆分并检测出个体感染者，使用病毒特异性“区别”NAT检测确认，阳性者纳入转诊和报告系统•美国北卡卫生部门制定和实施了全州所有公共HIV检测点筛查AHI规划，对所有抗体阴性样本进行集合NATRNA检测。及时转诊、咨询、治疗和前瞻性研究如何发现HIV急性感染AHI？RNA+Ab-P24+Ab-血清阳转后的方法RNAp24Ab血清阳转抗体检测临界值特异性抗体比例时间反应指标感染血清阳转前的方法怎样检测HIV-1早期感染?从感染HIV到抗体呈阳性反应这段时间血浆中含有高浓度HIVRNA有很高的传染性现在普遍认为2周～3个月,个别案例达6个月。HIV血清阳转窗口期HIV感染各种检测方法的窗口期HIVAb检测（第三代试剂）：窗口期约28天HIVAb/Ag联合检测（第四代试剂）：窗口期约15天核酸检测：窗口期约10天•病毒载量值范围为3.84~6.84Log10Copies/mL；•28例窗口期病例，病毒载量百万级有10份（35.71%）；十万级9份（32.14%）；万级的样品7份（25%）；万级以下的样品2份，占总样品数的7.14%。窗口期感染者的病毒学特征WB条带WB不确定RNA阳性p2426(65%)7(26.9%)p24+gp1609(22.5%)3(33.3%)p24+p174(10%)4(100%)p24+p551(2.5%)1(100%)合计401540份WB不确定样品WB条带HIV急性期感染或窗口期感染检测方法1.Ab/Ag联合检测:ELISA2.HIVRNA检测:集合PCRHIVAb/Ag联合检测检测早期HIV感染的效果与单独HIV-1抗原的试剂相当与RT-PCR方法相比，平均滞后时间是大约3.23天与第三代抗体试剂相比，窗口期缩短了1.56到5.32天检测献血员的特异性是99.80%第四代试剂的敏感性和特异性均有所提高HIVAb/Ag联合检测试剂的原理HIVAg检测：HIVAg固相血清/血浆结合物1/结合物2HIV1Ab:抗p24单抗………..…生物素标记的抗HIV单抗……..亲和素标记的过氧化物酶结合物TMB/H2SO4PHIVAb检测:IgG,IgA,IgM固相血清/血浆稀释液/结合物2HIV1Ag:gp160重组蛋白………………………………..gp41多肽过氧化物酶结合物功能性保守多肽………………….....................功能性保守多肽过氧化物酶结合物HIV2Ag:gp36多肽…………………………………..gp36多肽过氧化物酶结合物TMB/H2SO4PHIVAb/Ag特点HIV-Ab与HIV-Ag双检测系统—HIV-Ag和HIVP24抗体共同包被—HRP标记HIV-Ag和HRP标记亲和素共同组成酶标试剂双抗原夹心法测HIV-Ab——包被抗原+HRP标记抗原双抗体夹心LAB法测HIV-Ag——包被抗体＋生物素标记抗体＋HRP标记亲和素生物素-亲和素反应系统应用HIV-Ag/Ab试剂对BBIpanel检测结果24种国外抗体试剂窗口期与万泰试剂一致，均27天。ABBOTT（2种）、万泰和伯乐抗原试剂窗口期均为7天，灵敏度一致。集合HIVRNART-PCR样本的路线集合的拆分检测路线一级pool二级pool单份样品WB检测结果地点编号病载编号病载编号病载（C/ml）ZC1-51.68E+3ZC1LOWLOWZC2LOWLOWZC3LOWLOWZC44.43E+3230361.80E+5阴性豫-柘城ZC5LOWLOWZC11-153.92E+2ZC11LOWLOWZC12LOWLOWZC13LOWLOWZC141.37E+3231351.05E+4阴性豫-柘城172346.34E+3阴性晋-绛县ZC15LOWLOWTF1-51.36E+3TF1LOWLOWTF24.06E+3172185.39E+3阴性晋-绛县TF3LOWLOWTF4LOWLOWTF5LOWLOWTFD7.26E+4TFD13.32E+5050193.21E+6阴性晋-临汾TFD2LOWLOWTFD3LOWLOWTFD4LOWLOWTFD5LOWLOWLow：低于检测限HIV窗口期感染样品各级POOL检测结果50份标本混合阳性每10份标本再检测阳性每一份标本再检测集合HIV核酸检测用于血液筛查集合HIVRNA检测方法用于在HIV抗体阴性的血清（血浆）样本中筛查处于急性感染期HIVRNA阳性的样本。注*RT1和RT2检测均为阴性的样品为按阴性咨询同时，为进一步排除假阴性的样品将保留血浆，集中进行ELISA复检，ELISA复检为阳性的样品进一步做WB确认，同时进行随访。咨询后，需要检测者采集抗凝血先用RT1再用RT2进行检测按阴性咨询报告阴性任何一种试剂检测为阳性两次检测均为阴性集中进行ELISA检测*集中进行ELISA、WB检测求询者HIV抗体阴性及WB不确定样本WB确认HIV抗体阳性样品做PooledHIVRNART-PCR检测做BED-CEIA检测窗口期检测程序应用集合PCR技术发现窗口期感染者MSMVCTIDU筛查-筛查+集合PCRWB+结合流行病史，判断窗口期感染MSM人群早期感染建议检测流程2020/3/8男男性行为人群HIV-1早期感染检测策略及新发感染率研究集合核酸检测MSM人群样品四代ELISA检测阳性阴性阳性阴性WB检测不确定核酸检测HIV-1阴性样品HIV-1阳性样品阳性阴性WB检测不确定三代ELISA检测婴幼儿HIV感染的诊断HIV感染产妇生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸检测进行早期HIV感染诊断。逆转录PCR（RT-PCR）方法，一般需扩增HIVgag和pol和env基因片段。如果儿童第一次采血时已满12个月，则应首先进行HIV抗体检测。对于抗体阳性者进行HIV核酸检测。如果已满18个月，不做核酸检测。感染婴儿平均S/CO值随月龄变化曲线（24个感染婴儿(3个死亡)，82个样本）n:样本数婴幼儿感染诊断：12月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性者检测核酸，18个月以上抗体检测HIV感染产妇所生婴儿尽快采集第二份血样本，送检出生后6周采集第一份血样本（可制备成滤纸片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送检继续随访报告阳性婴儿满3个月，再次采集血样本，送检尽快再次采集血样本，送检报告阴性呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阴性反应核酸检测流程快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测方法。快速检测，是为了更多、更快的的发现感染者。快速检测，不是为了取代实验室，但不能因为有了实验室而放弃使用快速检测。快速检测“五扩大七加强”扩大宣传教育覆盖面扩大监测检测覆盖面扩大预防母婴传播覆盖面扩大综合干预覆盖面扩大抗病毒治疗覆盖面加强血液管理加强医疗保障加强关怀救助加强权益保护加强组织领导加强防治队伍建设加强国际合作国务院国发【2010】48号：扩大监测检测覆盖面要进一步加强监测检测网络建设，依托现有医疗卫生资源，配备必要的设备和人员，扩大检测服务范围，推广使用快速简便的检测方法，提高检测可及性。组织各级各类医疗卫生机构主动开展艾滋病病毒检测咨询。建立快速检测点，扩大检测覆盖率我国地域辽阔，在一些有检测需求但尚不具备条件建立实验室的医疗机构、农村乡（镇）卫生院、社区卫生服务中心和艾滋病自愿咨询检测点（VCT）需要建立快速检测点，以扩大检测覆盖面、发现更多的艾滋病病毒感染者。年HIV报告即AIDS新发现合计晚发现%200737419107194813822.3200845572107905636219.1200948193134336162621.8201048249160896433825.0疫情的新特征（病人发现晚）要求开展快检以尽早尽快发现增加检测可及性是中国控制艾滋病的关键1.知晓HIV感染状况能够得到有效的阳性的干预。2.通过行为改变可以减少2/3的HIV经性传播。3.及时的抗病毒治疗可以减少病毒载量从而减少二代传播–“治疗作为预防”—90%以上的效能。4.如果有60%的HIV+知晓自己的感染状态并获得相应服务——HIV疫情达到控制。5.为什么目前HIV+发现率不高25%？主动检测的渠道有限（主要通过CDC系统，医院初检阳性的丢失率高），检测过程繁琐（出结果时间太长，二次随访失访）。中国HIV感染知晓率（2010年）010000020000030000040000050000060000070000080000030700074000021000010660041%of“Follow-up”31%loss14%onTreatment28%知道自己感染在中国增加检测可及性的关键HIVTestingSites–Increase1.增加HIV检测点HIVTestingprocedures–Simplify(UserFriendly)2.简化HIV检测流程——越快越好，同一场所两次检测将会促进可及性，大大减少结果告知以及随访过程中的丢失，简化检测，比如使用快检会使更多更低级别的场所能够提供HIV检测——增加可及性。2020年3月8日星期日©2010Bill&MelindaGatesFoundation|351.快速检测是区别于常规ELISA的一种初筛方法，只是艾滋病实验室多了一种检测方法。2.快速检测是在不具备筛查实验室条件的地点开展目标人群的检测，是为了更多、更快的发现感染者。3.开展快速检测仍然需要经过专业培训，接受上级有关部门监督和管理，检测点不是为了取代实验室，只是筛查实验室的补充。快速检测的定义国家参比实验室：RT1+RT2组合结果流行率0.10.1=流行率0.3流行率=0.3-/-+/+Total-/-+/+Total-/-+/+Total-22252