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临床基因扩增检验的质量保证李金明卫生部临床检验中心Tel.010-58115061Email:jmli63hn@gmail.com2014.9.25.杭州问题？z什么叫质量保证？与质量控制有何区别？z室内质控？室间质评？z基因扩增实验室到底要分多少个区？缓冲间有何作用？使用什么样的生物安全柜？z“无基因”或“无核酸”概念？z质量管理的“灵魂”？z试剂方法的性能验证如何做？z自配试剂自建方法可以吗？z基因突变和基因多态性检测如何进行室内质控？z质量管理的“精髓”？z分子诊断的报告？临床分子诊断发展历程：几个里程碑z1953年:DNA双股螺旋的发现z1963年:放射免疫测定技术、核酸测序方法z1972~1973年:重组DNA技术z1983年:PCR测定技术z1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术z2003年：人类基因组计划基本完成。纳米和量子标记技术？z2011年-新一代测序技术诊断医学70%以上信息来自实验室诊断监测预后预测免疫和分子诊断是整个检验医学领域内发展昀快、昀有活力的，在疾病的诊断和治疗中往往有决定性作用！分子诊断对检验医学的划时代意义！质量保证(QualityAssurance,QA)z为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)z由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。z可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。室间质量评价（ExternalQualityAssessment,EQA）z为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（Proficiencytesting,PT）。在以前的文献中，EQA常描述室间质量控制。批(Run)z在相同条件下所获得的一组测定。（5个相同：地点、仪器、试剂、人员、时间）正态分布(Gaussiandistribution)z当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。正态分布的基本统计学含义可用均数（X)、标准差（SD)和概率来说明。临床基因扩增检验实验室常规测定步骤z标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。z实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。z报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。质量保证、室内质控和室间质评之间的关系分析前临床标本的正确采集、运送、保存的重要性z临床检验的质量保证关键性环节z解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一标本的类型z血清(浆)z分泌物z痰z粪便z尿z脑脊液z组织临床标本中PCR反应抑制物z内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。z外源性的:如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。结果的报告和解释遗传检测报告至少要包括的信息z将报告与特定患者联系在一起的惟一编号z咨询人员的姓名和联系方式z与检测结果解释有关的特异的信息和检测性能z检验项目及所使用的方法（包括检测范围及检测局限性）z标本类型z标本接收日期z检测实验室名称，地点，包括咨询实验室z检验结果z根据检测特性和其它提供给实验室的信息对结果的解释z报告批准人的签字z实验室联系方式z报告日期z适当时，还应包括：建议的有资质的遗传咨询人员；对其他家庭成员的意义；进一步的检测建议MM20-A.(vol.32.No.15)Qualitymanagementformoleculargenetictesting,Approvedguideline供参考的标准报告格式临床基因扩增检验的室内质量控制z测定前的质量控制z非统计和统计学质量控制z质量控制的评价测定前质量控制z实验室设施、仪器设备及管理z理想的试剂和操作方法z人员培训实验室设计z充分合理的空间z良好的照明z空调设备理想的PCR实验室设计A产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的PCR实验室设计B临床PCR实验室设计的一般原则z各区独立z注意风向z因地制宜z方便工作“十六字口诀”(1)在物理空间上，必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间还是在使用中，应始终处于完全的分隔状态;(2)不能有空气的直接相通。由清洁区域向污染区域流动门试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区外走廊门门门门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区外走廊门门门门AB试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门门空气流向空气流向空气流向走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向空气流向其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室门试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门空气流向空气流向+空气流向++走廊走廊试剂准备区标本制备区扩增和产物分析区空气流向空气流向+空气流向++其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室其他实验室空气流向产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗关于“分区”、缓冲间和生物安全柜产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。“无基因”或“无核酸”概念的重要性！！！尊敬的李教授：您好！来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！刘X20130508刘大夫：PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。此外，在实验室出现严重污染后，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。20130508李教授：您好！我是上次向您请教PCR实验室污染如何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现在实验室污染已经完全清除，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！2013.7.18尊敬的李教授：您好！您所说的措施我都实行过，只不过除通风外，其余措施仅实施过很少几次，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施要在三个区都进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响？谢谢您拨冗指教！刘X20130508样本号样本突变类型正确结果突变报告为野生野生报告为突变报告1个以上的阳性结果（含预期结果）报告错误突变结果（不含预期结果）检测失败样本检出率实验室数实验室比例KRAS-0112035485.7%2不适用52093.7%KRAS-0212065282.5%1不适用64092.1%KRAS-0312054571.4%2不适用124090.5%KRAS-04野生型6095.2%不适用300095.2%KRAS-0513015892.1%2不适用11193.7%KRAS-0612045384.1%4不适用03384.1%KRAS-0712025993.7%1不适用03093.7%KRAS-0812015790.5%2不适用21193.7%KRAS-0913016196.8%1不适用10098.4%KRAS-10野生型6298.4%不适用100098.4%2013年KRAS突变质评总体的检测情况各样本检出率大部分90%，假阳性结果较多。PCR-Sanger测序样本编号预期结果某研究所实验室KRAS-01G12VG12SKRAS-02G12CG12AKRAS-03G12RG12DKRAS-04WTG13AKRAS-05G13D野生型KRAS-06G12SG12VKRAS-07G12AG12CKRAS-08G12DG12DKRAS-09G13DG13DKRAS-10野生型野生型检测方法PCR-直接测序PT成绩9030样本编号预期结果某医院病理科实验室KRAS-01G12VG12VKRAS-02G12CG12VKRAS-03G12R野生型KRAS-04野生型野生型KRAS-05G13DG12D; G13DKRAS-06G12S野生型KRAS-07G12AG12AKRAS-08G12DGly12Asp 35GAKRAS-09G13DG12D; G13DKRAS-10野生型野生型检测方法焦磷酸测序PT成绩9050焦磷酸测序实验室仪器设备及管理z加样器：维护、校准z扩增仪：维护、校准z恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准z离心机：维护z生物安全柜：维护z冰箱：维护基因扩增仪器设备的质控仪器设备质控方法频度失控标准扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败热电偶监测温度扩增功能检测每月一次每4个月一次如靶温度或温度差异超出允许范围待测孔未出现扩增，检测温度程序打印每次测定时打印程序不对加样器校准每年2次不符合要求水浴箱温度检测每次实验不符合要求酶标仪预防性维护及校准每年2次不符合要求离心管、吸头等的质检z带滤芯吸头的密封性z离心管PCR抑制物质检理想的试剂z试剂方法的性能验证及每批试剂的质检z性能指标：重复性准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）线性范围（定量）分析特异性测定下限抗干扰能力自建方法和自配试剂z有严格的试剂制备SOPz建立相应的性能指标：重复性、准确性、特异性、测定下限和抗干扰能力等z应做成一个试剂盒的样子：名称、方法、制备日期、制备人、有效期等z有使用说明书理想的操作方法z定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根(SD)=上式中SDa、SDb、SDc是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、扩增和产物检测等）的标准差SDSDSDabc222+++......理想的试剂和操作方法z改善测定精密度的措施必须首先着重在昀不精密的步骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP)质量管理的发展z经验管理z质量检验管