荧光定量PCR

荧光定量PCR原理和方法介绍提纲•荧光定量PCR的原理和应用•荧光定量PCR实验的设计和优化•仪器软件的操作和仪器的维护•引物和探针的设计•常见问题及解决方案荧光定量PCR的原理PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分变性延伸5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq重复退火5’3’3’3’3’5’3’3’5’3’3’循环24个拷贝循环38个拷贝3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’Cycle#TheoreticalRealLifeLogTargetDNAPCR反应模式RelativeFluorescence终点检测同一样品重复96次的实验结果Lockeyetal.(1998)Biotechniques24:744-6终点法和实时法的结果比较实时PCR（realtimePCR）能够在扩增的同时对扩增产物的量测量或定量。00.40.81.21.6201020213040ThresholdBaselineSampleCTCt值的设定扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。1)设定基线2)设定阈值3)CT值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。阈值设定的越高，CT值越大。CycleCt值和起始模板量的对应关系Templateabundancein6samples.23.823.723.6LowCt,highamount35.635.335.2HighCtlowamountCorrelationCoefficient,SlopeandPCREfficiency(cont.)相关系数标准曲线的斜率和扩增效率相关Efficiency()=[10(-1/slope)]-1荧光PCR的原理•插入染料法•杂交探针法5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分变性插入染料方法的原理插入染料TaqIDl延伸5’3’5’3’检测激发的荧光5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaq退火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDlllll相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜不需要特别设计探针SYBRGreenI,最常用的插入染料SYBRGreen染料插入双链DNA，检测灵敏度提高1000倍。和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低。不能做多重PCR。插入染料能够和引物二聚体和非特异性扩增产物结合杂交探针方法•TaqMan探针•分子信标探针（MolecularBeacons）•FRET探针TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应体系变性TaqlRQProbeRQ5’3’RQ退火5’3’1.链取代TaqQR5’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’TaqR5’4.检测荧光5’3’TaqR5’l产生很强的荧光信号容易设计和合成可以做多重检测能够进行SNP(SingleNucleotidePolymorphism)检测比插入染料贵Tm值比引物高10℃长度不超过30bp5’端不能是GTaqman探针设计5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分分子信标(MolecularBeacons)变性TaqRQRQMolecularBeacon5’3’5’3’1.链替换Taq2.聚合完成lRQ退火RQ5’3’5’TaqRQMolecularBeaconSNP检测，较Taqman探针有更大的温度选择性多重PCR难设计和合成产生的荧光信号较低价格昂贵5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分FRET探针变性TaqRQFRET探针5’3’lDR5’退火5’3’链替换,荧光熄灭5’3’5’TaqD1-5basesTaqR5’•特异性好•SNP检测•难设计•费用昂贵TexasRed,ROXCY3.5,RedmondRed常用的荧光基团FAMTET,VICCY5CY5.5,LC705LC640HEXJOECY3TAMRA应用•相对定量•绝对定量•突变检测•等位基因检测相对定量参考基因：Actin,GAPDH,18sRNA靶基因AGAPDHΔCt对照组25.219.55.7实验组22.120.81.31．计算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因－CtGAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt=－4.4。3．计算相对表达量的差值。2－ΔΔCt绝对定量构建标准曲线：A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。B、利用纯化的扩增产物制备C、克隆有扩增产物的质粒突变检测熔点曲线分析功能•SYBRGreen•FRET探针•分子信标探针等位基因功能•MGB探针•Taqman探针？熔点曲线分析反向引物的中间用Cy5标记和wildtype杂交的探针用FAM标记不对称PCR，提高反向引物浓度SNP检测-FRET混合型野生型突变型等位基因功能MGB探针实验设计和优化影响PCR的因素•扩增效率——非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物的长度和二级结构•重复性•敏感性•动力学范围GoodBad=131%r=0.982=101%r=0.997好坏数据比较Notemplatecontrol400copies10,000copies2,000copies引物二聚体Tm=78°C引物二聚体对结果的影响特异性产物Tm=89°C82ºC采集荧光信号=66.3%ReverseprimerA1110ForwardPrimerReversePrimerA避免二级结构=95.8%ReverseprimerBForwardPrimer1110ReversePrimerB2ndgeneration-85bpampliconAvoidSecondaryStructure(cont.)OptimizingPrimerlocation定量方法的选择•绝对定量？动力学范围？•相对定量？参考基因？扩增效率？扩增片段•扩增片段的大小•探针的区域•序列的特异性•490nm：FAM/SYBR•530nm：HEX/TET/VIC/CY3•575nm：TexasRed/ROX•635nm：CY5/LC640荧光标记PCR反应•分开扩增？•同时扩增（二重PCR）？实验条件的优化•Taq酶，Mg2+•dNTPs•引物浓度•探针浓度•退火温度CT值越小，表明反应效率越高多重PCR的优化•标准品的动力学范围•反应条件的优化：降低高丰度基因的引物浓度，提高低丰度基因的引物浓度相对定量的扩增效率101520253035402345678FAMTubulinHexGAPDHHexGAPDHHexGAPDH线性(HexGAPDH)线性(HexGAPDH)线性(HexGAPDH)线性(FAMTubulin)Concentration(10n)ThresholdCycle101520253035402345678FAMTubulinHexGAPDHHexGAPDHHexGAPDH线性(HexGAPDH)线性(HexGAPDH)线性(HexGAPDH)线性(FAMTubulin)ThresholdCycleConcentration(10n)ΔCt比较y=0.0827x+0.5885R2=0.231400.20.40.60.811.21.42345678Δct线性(Δct)Concentration(10n)ΔCt•RNA逆转录效率•提取效率PCR污染问题•UNG酶•分区•单独的移液器•带滤芯的tip•紫外照射引物和探针的设计•查找文献•确定目的基因•查找基因序列•序列分析•引物与探针的设计•验证引物与探针的特异性引物设计原则•长度：20-27nt•G+C含量：45-55%•碱基的随机分布：3’端不应超过3个连续的G或C•引物自身：不应存在互补序列•引物之间：不应有互补性，尤应避免3’端的互补重叠•引物的3’端:3’也不能有形成任何二级结构的可能•引物的特异性探针设计原则•序列保守•G+C含量比较高•Tm值：高10℃•5’端不能是G•PrimerExpress•BeaconDesigner引物和探针的设计谢谢!