荧光定量PCR技术

荧光定量PCR解决方案TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD内容概要荧光定量PCR的原理及标记方法荧光定量PCR数据计算方法荧光定量PCR文献解读MIQE标准及实验常见问题分析定量PCR引物设计技巧Real-timePCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术的比较：1.对PCR反应终产物进行定量和定性分析（电泳）2.无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时监测荧光定量PCR原理－－定义扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理－－常用名词概念Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphase平台期荧光基团荧光检测元件荧光定量PCR原理－－扩增曲线Cycle（循环数）Rn（荧光强度）BaselineLog－linerphase前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）真正的信号:荧光信号超过域值，进入指数扩增期之后荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段Threshold荧光定量PCR原理－－荧光域值平台期Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值理想的PCR反应Xn＝X02n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理非理想的PCR反应Xn＝X0（1＋En）n*Xn：第n次循环后扩增产物数量X0：起始模板数量n：扩增循环数En：扩增效率荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为CtXCt＝X0（1＋En）Ct＝M（1）*XCt：在阈值设定以后，XCt是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为M方程式（1）两边同取对数得：LogM＝LogX0*（1＋En）Ct（2）整理方程式（2）：LogX0＝LogM－CtLog（1＋En）荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration起始模板量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。荧光定量PCR原理－－Ct值与起始模板量的关系同一个样品重复96次PCR的扩增曲线荧光定量PCR原理－－PCRvsqPCR定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯片结果验证，差异显示结果验证等荧光定量PCR技术的应用内容概要荧光定量PCR的原理及标记方法荧光定量PCR数据计算方法荧光定量PCR文献解读MIQE标准及实验常见问题分析定量PCR引物设计技巧非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe分子信标常用荧光标记方法SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理问题点：SYBRGreenI与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。SYBRGreenI染料法——问题点与关键点关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT)原始图谱对数图谱SYBRGreenI染料法——融解曲线融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreenI染料法——融解曲线Taqman探针法——原理5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针Taqman探针法——工作机理热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR实时荧光定量PCR的分类－－几种方法的比较方法优点缺点适用范围SYBRGreenI方法适用广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对多个目的基因定量分析，基因表达量的研究TaqMan方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标适合病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病的诊断HRM方法特异性极高区分度高对仪器及试剂要求较高种系的差异研究、SNP等单碱基突变研究内容概要荧光定量PCR的原理及标记方法荧光定量PCR数据计算方法荧光定量PCR文献解读MIQE标准及实验常见问题分析定量PCR引物设计技巧荧光定量PCR的解析方法（依据课题要求提前确定）绝对定量解析方法相对定量解析方法绝对定量解析方法Sample25绝对定量的定义Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒目的基因基因组DNA质粒标准品的制备拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v质粒标准品稀释方法与拷贝数计算方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBVDNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数。绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone实验数据绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量扩增效率（E）计算E=10-1/斜率－1=10-1/-3.29－1=2.01－1=1.01标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.29x+40.33R2=0.9978绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.2,越接近1，越理想。未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.29X+40.33QuantityUnknown=106.03=1,071,519copies绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量X=20.5-40.33-3.29=6.03相对定量解析方法理论上目的基因表达量分析条SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析相对定量的必要性必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等筛选方法根据文献提供通过具体实验筛选相对定量分析——管家基因筛选0123456Sample1Sample2Sample3Sample4实验组实验值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTPPPO双标准曲线法2-△△Ct法(CT值比较法)相对定量分析——两种常用的分析方法通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果待测样品的校正值对照样品的校正值相对定量分析——双标准曲线法公式：优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一相对定量分析——双标准曲线法检测样品管家基因H目的基因X定量结果定量结果校正值相对量对照样品6391.5343.40.05371.000待测样品18589.717.30.00200.037待测样品27432.91946.10.26184.874实验数据公式：F=2－相对定量分析——2法优点：无需作标准曲线缺点：假定扩增效率接近100%；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一待测组目的基因平均Ct值待测组管家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组管家基因平均Ct值－－－－△△Ct｛｝实验数据：Sample处理前处理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.40.950.952-△△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%△Ct（处理前）＝18－17＝1△Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（处理后/处理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的5.3倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于1，那么2－△△Ct可以修正为：（1＋E）－△△Ct，例如扩增效率为0.95，那么计算公式可修正为1.95－△△Ct相对定量分析——2-△△Ct法荧光定量PCR文献分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD经典文献刊物：PLANTCELL（植物细胞）（9.865）单位：中科院遗传所植物基因组国家重点实验室&弗莱堡大学&明尼苏达大学经典文献刊物：JournalofExperimentalBotany（实验植物学杂志）（4.125）单位：清华大学&新加坡国立大学研究内容Paper1：通过拟南芥突变株(jdl1/asa1-1)分析了茉莉酸和植物激素的相互作用来调节拟南芥的侧根形成，ASA1基因在茉莉酸介导的植物激素生物合成和运输调节中的重要性。Paper2：通过分子学和生理学的方法分析了拟南芥中茉莉酸诱导的花青素积累的分子机制，表明其主要是通过调节转录因子PAP1、PAP2、GL3的表达，进而调节花青素后期合成基因DFR、LDOX、UF3GT的表达，最终调节了拟南芥中茉莉酸诱导的花青素的生物合成。共同点:信号诱导的植物生长发育的分子机制实验思路和技术方法jdl1/asa1-1是茉莉酸诱导响应型-MeJA培养实验ASA1-Trp合成限速酶分子克隆/底物回补实验ASA1对IAA合成的重要性RNA凝胶印迹/qRT-PCR茉莉酸调节-运输元件PIN1/PIN2/AUX11的表达qRT-PCR茉莉酸诱导跟乙稀无关MeJA&ACC培养实验JA特异诱导花青素的积累MeJA/其他激素培养COI1的必要性—后期合成基因DFR、LDOX、UF3GT表达RNA凝胶印迹/qRT-PCRCOI1的必要性—转录因子PA1、PA2、GL3的表