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1第3章农业微生物技术第一节农业微生物概述一、授课章节第一节农业微生物概述。二、学时安排2学时。三、教学目标1．掌握微生物定义、特征、分类、命名法则。2．掌握微生物大小形态。3．掌握微生物的结构。4．了解微生物的生活史。5．熟悉微生物的营养。四、教学重点、难点分析重点：1．微生物的定义、命名法则。2．微生物的结构形态。难点：1．微生物结构。2．微生物命名法则。五、教具电化教学设备。六、教学方法讲授法，多媒体课件。七、教学过程Ⅰ导入本次课主要讲述微生物的基础知识，包括微生物定义、命名法则、形态结构等方面的知识。II新课一、微生物定义、分类21．定义微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称，通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类。2．微生物的分类★简单分类★六界系统1969年，魏塔克，六界分别是病毒界、原生生物界、原核生物界、真菌界、植物界、动物界。★三界学说1990年，伍斯，细菌域、古生菌域和真核生物域。★安斯沃思(Ainsworth,1971)系统分为真菌门和黏菌门，而真菌门又分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。3．微生物的命名法则采用林奈双名法，此为国际命名法规，即每一微生物的学名都依属与种而命名，即属名+种名+（首次定名人）+现定名人+定名年份。属名：拉丁文的名词或作名词的形容词，字首大写，表示微生物的主要特点。种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字首小写。出现在分类学文献中的学名，在上述两部分之后还应加写3项内容，即首次定名人（正体字，用括号括住）、现名定名人（正体字）和现名的定名年份。如在一般书刊中出现学名时，则不必写上后3项内容。如Escherichiacoli（大肠杆菌），Escherichia是属名，第一个字母大写；coli是种名，小写；均用斜体字。三、微生物形态与大小1．微生物的形态细菌个体的基本形态可分为：球状、杆状和螺旋状，分别称为球菌、杆菌和螺旋菌；非细胞生物病毒、亚病毒细胞生物真菌、单细胞藻类、原生动物原核生物真细菌、古细菌真核生物微生物3放线菌的菌体为单细胞原核分支的放射状丝状体，菌丝体分为基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝和孢子丝；酵母菌的个体类似细菌，大多数为单细胞，一般呈球形、卵形或圆柱形，有些菌体能互相连接并延长成菌丝体，称假菌丝；霉菌营养体的基本单位是菌丝，菌丝通常呈管状。低等霉菌的菌丝没有横隔膜，称无隔菌丝，整个菌丝就是一个单细胞，菌丝内有许多核；高等霉菌的菌丝有横隔膜，称有隔菌丝，横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，每个细胞含有1至多个细胞核。菌丝也像放线菌那样分为基内菌丝和气生菌丝，在气生菌丝顶端可产生各种孢子；担子菌和霉菌一样，也形成绒毛状的菌丝体，并能进一步形成大型子实体。2．微生物的大小细菌中单个球菌的直径多为０.５～１μm，杆菌多为（０.５～１）μm×５μm，螺旋菌多为（０.５～２）μm×（１～５０）μm。放线菌的菌丝，宽度１μm左右，无横隔。酵母菌比细菌大得多，宽１～５μm，长５～３０μm。霉菌的菌丝，粗细不一，一般宽５～10μm，少数小至０.５μm，大到100μm。3．微生物的菌落特征微生物在固体培养基上，由一个菌体在一定温度下经过一定时间的培养，生长繁殖成为肉眼可见并具有一定形状的群体结构，称为菌落。菌落的形状、大小、颜色、透明度、光泽及边缘形状等特点，因菌种不同而异，因而可作为菌种鉴定的依据。细菌的菌落多数表面光滑、湿润、半透明或不透明，大多数呈圆形，也有呈分枝状或不规则扩展状。有的有颜色，有的表面干燥有褶纹。直径一般１～４mm。菌体与培养基结合不紧，用挑针容易挑起。放线菌在固体培养基上一般为圆形、平坦或有皱褶，边缘有辐射状菌丝，质地紧密、坚实、不能无限扩张，形成孢子后，表面呈粉末状。由于菌丝和孢子都具有色素，所以菌落表面和背面的颜色往往不同。正面是孢子丝和孢子层的颜色，不同种类具有不同而稳定的色泽；背面是营养菌丝以及它们所分泌色素的颜色。酵母菌的菌落形状与细菌的菌落相似，但比细菌菌落大而厚，多数不透明，一般为圆形，表面光滑、粘稠、湿润呈油脂状，多数为乳白色，少数为粉红色或红色，用接种针很容易从菌落中将菌挑起。培养时间较长的菌落，表面呈皱纹状，较干燥，颜色往往变暗。霉菌的菌落由无数分支状菌丝体组成，呈绒毛状，棉絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍至几十倍。在固体培养基上，霉菌菌落一般比较疏松，有些生长快的种类，能迅速蔓延扩展；有些种类生长则有局限性。菌落最初呈白色或浅色，这是菌丝的颜色。随后从菌落4的中央逐渐向外扩展，在菌丝上长出各种颜色的孢子，有时菌丝也能分泌一些色素，扩散到培养基内。所以不同霉菌在培养基的正面和反面显示出不同颜色，这些特征是鉴别霉菌的重要依据。四、微生物结构1．原核微生物的结构细菌的细胞一般具有细胞壁、细胞膜、细胞质及原核等基本结构。有些还具有鞭毛、荚膜、芽孢等特殊结构2．真核微生物的结构酵母菌细胞由细胞壁、细胞膜、原生质、细胞核和其他内含物组成。霉菌菌丝细胞的构造同酵母菌细胞相似，菌丝隔膜的中央有极小的孔，细胞质或养料可互相沟通，细胞核也可以通过。五、微生物生活史1．原核微生物生活史2．真核微生物生活史六、微生物营养代谢1．微生物营养物质微生物的生长需要碳源（凡能供给微生物碳素营养的物质）、氮源（凡能供给微生物氮素营养的物质）、无机盐（包括主要元素和微量元素）、生长因子（凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质）、能量（光能或化学能）和水六大营养要素。2．微生物的营养类型根据微生物所需的碳源和能源的不同，将微生物分为光能自养型、光能异养型、化能自养型、化能异养型四种营养类型。3．微生物培养基培养基是以人工方法按照微生物的需要，用多种物质调制而成的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物需要的一种营养基质。III作业1.微生物命名法则是什么？2.简述微生物的概念和特征？3.如何对菌落进行形态描述？5第二节农业微生物分离技术一、授课章节第二节农业微生物分离技术。二、学时安排2学时。三、教学目标1．了解微生物分离基本思路。2．掌握土壤中细菌分离的方法步骤。3．掌握植物真菌分离的方法步骤。四、教学重点、难点分析重点：1．细菌分离方法、步骤。2．真菌分离方法、步骤。难点：1．细菌分离步骤。2．真菌分离步骤。五、教具电化教学设备。六、教学方法讲授法，多媒体课件。七、教学过程Ⅰ导入上节回顾：上节主要讲述了微生物基础知识，主要为微生物定义、分类、命名、结构、生活史、营养等方面的内容。本节主要讲述农业微生物的分离技术，重点讲述细菌和真菌的分离技术。II新课一、微生物分离概述1．菌种分离的方法和种类将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫做分离；在6特定环境中只让一种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫做纯化。稀释法中的稀释涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法较为常用，而鉴别分离法以鉴别培养基分离技术较为常见；丝状真菌和放线菌分离常常采用组织分离法、孢子分离法、饵诱法等等。2．优势菌的分离思路一般采用以下思路：细菌和单细胞微生物可以进行稀释，从而使得每一个细胞繁殖形成单菌落，进行分离；而丝状真菌可以进行孢子稀释，进而繁殖形成单菌落，在菌落还没产生孢子前，将平板上的单菌落挑出，进而得到纯化。3．不占优势菌的分离思路一般采用以下思路：先进行富集培养，即从微生物混合群开始,不断增加特定种的数量比例而引向纯培养，将要分离的目的菌数量提高上去以后，进而采用优势菌分离的思路进行分离。二、土壤中细菌的分离1．土壤中细菌分离所需要的工具2．土壤中细菌分离技术路线3．土壤中细菌分离步骤（1）查资料、定方案通过查阅资料，确定目的菌的采样地点、季节，分离的培养基配方、分离手段、鉴别手段、纯化方法等等，最终确定整个分离方案。（2）土壤样品采样采集土壤样品时，按统计学观点取样（图3-18），确定取样点。选好取样地点后，用小铲子除去表土，用采集器（图3-19，3-20，3-21，3-22）取离地面5～15cm处的土约10g，盛入事先灭菌的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽量少变化，宜将样品分批带回实验室，以便及时分离。（3）土壤样品预处理样品预处理是制备菌悬液的过程，也是土壤浸提液的制备过程。首先将样品放到事先灭菌的研钵中研碎混匀，取5g置于事先放入玻璃珠的无菌三角瓶中，加入无菌水100mL，振荡摇匀5min，3层纱布过滤，取滤液备用。（4）稀释分离7首先，将制备好的菌悬液，置于60℃水浴15min，进行梯度稀释（10-1，10-2，10-3……10-10），涂布于事先制备好的NA平板（牛肉膏蛋白胨培养基）上，然后30℃下培养，24h后观察。（5）纯化挑取培养平板上长出的乳白色菌落，接种到试管斜面上，30℃下培养，24h后观察，如发现菌落生长不均一，重复稀释法，直至纯化至满意为止。（6）鉴定及性能测试根据细菌鉴定方法（以《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》为准）对细菌进行鉴定，并对有意义的生产性状进行进一步地研究。4．土壤中细菌分离操作要点（1）梯度稀释操作时，应注意每个稀释度的样品一定要摇匀。（2）移液管口部灭菌前，要放置棉花，用报纸包扎好，灭菌备用。棉花可以起到过滤保护的作用。（3）从每个梯度取样时，应注意每个梯度更换一支无菌移液管，防止交叉感染。（4）涂布平板时，涂布器在培养皿中要正转三圈，反转三圈，涂布均匀。5．土壤中细菌分离的注意事项（1）采集来的样品应及时进行分离，不能立刻分离的应放于4℃冰箱中保存，保存时间不得超过24h。原因是微生物区系时刻发生着变化，越早分离越能分出原生态系中的菌种，减少由于环境变化引起的杂菌滋生。（2）土样浸提液水浴温度不可高于75℃（非芽孢菌不要水浴），时间不得少于10min，原因是温度过高会使一些耐热性较差的芽孢死亡，水浴时间过少，非芽孢菌存活下来的较多，造成分离的困难。三、植物上的真菌分离1．植物上的真菌分离所需要的工具2．植物上的真菌分离技术路线3．植物上的真菌分离步骤（1）查资料、定方案通过查阅资料，了解植物病原真菌的分离方法、真菌特性、培养基配方及培养条件等，确定方案。（2）植物采样采样样品时的天气最好选择阴天多云的日子，选择采集典型的病部叶片，叶斑病害应取8病健交界处进行分离。样品应尽快送往实验室分离。（3）植物样品预处理采集的叶片，先用洁净的清水洗去叶片上的灰尘和杂物，晾干备用。（4）分离取真菌性叶斑病的新鲜病叶，用剪刀剪取病健交界处的组织(边长4～5mm)数块；将病组织放入70%酒精中浸3～5s后，将病组织在0.1%升汞(氯化汞)液中消毒1min，然后在无菌水中连续漂洗3次，除去表面残留的消毒剂；按无菌操作规程将病组织移入平板培养基表面上，一般每皿放4～5块，并用玻璃铅笔注明培养材料的编号和种类；将平板培养基倒置后放入恒温箱内，在25℃下培养3～4d后，将分离的目的菌在无菌条件下移入斜面培养基上，淘汰杂菌。（5）纯化待平板上长出菌丝时，用解剖刀将菌落边缘切下，移入试管斜面，25℃培养，待长好后，4℃保藏备用。（6）菌种鉴定及性能测定根据真菌鉴定方法（以魏景超《真菌鉴定手册》为准）对真菌进行鉴定，并对有意义的生产性状进行进一步地研究。4．植物上的真菌分离操作要点（1）无菌水水洗时，每次不得少于3min，洗涤时必须不断振荡，尽量洗下残留的升汞溶液。（2）70%酒精处理时间不得多于30S，否则，叶片组织容易变黑，分离难度增大。（3）培养基可以选用PDA培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17～20g，水1000mL），可以在此培养基中加入1~5%的植物组织浸提液，可提高分离效果。（4）为了防止杂菌污染，可以加入抗生素，抑制杂菌，提高分离效果。例如，青霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素等。5．植物上的真菌分离注意事项（1）升汞可先配成母液。方法是：升汞20g，加浓盐酸100mL，使用时取5mL原液加9