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氨基酸发酵工艺学第一节学习氨基酸发酵工艺学的目的、研究对象、任务及内容氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物——氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢,使有用产物大量生成、积累。以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸发酵生产以发酵为主,发酵的好坏是整个生产的关键,但后处理提纯操作和提纯设备选用当否,也会大大影响总的得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终产品获得的整个过程,其中有微生物生化问题、生化工程问题,也有分析与设备问题。今后的发展是采用诱变、细胞工程、基因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种,提高产酸;采用过程控制,进行最优化控制,连续化、自动化,稳产、高产;探求新工艺、新设备,以提高产率和收得率;研究发酵机制等问题,以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。绪论第一章淀粉水解糖的制备第一节淀粉的组成及其特性淀粉为白色无定形结晶粉末,淀粉的形状有圆形、椭圆形和多角形三种。淀粉颗粒的大小随淀粉种类的不同而差别很大。淀粉的组成:淀粉分子是由许多葡萄糖脱水缩聚而成的高分子化合物,用(C6H10O5)n这个实验式来表示。淀粉一般可分为直链淀粉和支链淀粉两部分。直链淀粉是由不分支的葡萄糖所构成,葡萄糖分子间以α-1,4-糖苷键聚合而成,呈链状结构,聚合度约100～600之间,它的水悬浮液加热时,不产生糊精,而以胶体状态溶解,遇碘反应是纯蓝色。支链淀粉(胶淀粉)其直链由葡萄糖分子以α-1,4-糖苷键相连结,而支链与直链葡萄糖分子以α-1,6-糖苷键相连结,分子呈树状,它是一种膨胀性的物质,置于水中加热时成为胶粘的糊状物,而且只有在加热加压的条件下,才能溶解于水,遇碘呈紫红色反应。淀粉没有还原性，也没有甜味，不溶于冷水、酒精、醚等有机溶剂中。淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊，这个过程称为糊化。第一阶段:淀粉缓慢地可逆地吸收水分,淀粉颗粒已有些微膨胀。第二阶段:当温度升到大约65℃时,淀粉颗粒经过不可逆地突然很快地吸收大量水分后,膨胀粘度增加很大。第三阶段:当温度继续升高,淀粉颗粒变成无形空囊,可溶性淀粉浸出,成为半透明的均质胶体。第一章淀粉水解糖的制备第二节淀粉水解糖的制备方法一、淀粉水解糖的生产意义和水解糖的质量要求二、淀粉水解的方法及其比较1、酸解法2、酶酸法3、酸酶法4、双酶法第一章淀粉水解糖的制备第三节双酶法制糖工艺淀粉双酶法制糖工艺主要包括:淀粉的液化和糖化两个步骤。液化是利用液化酶使淀粉糊化,粘度降低,并水解到糊精和低聚糖的程度。糖化是用糖化酶将液化产物进一步彻底水解成葡萄糖的过程。第二章谷氨酸发酵机制第一节谷氨酸的生物合成途径一、生成谷氨酸的主要酶反应(1)谷氨酸脱氢酶(GHD)所催化的还原氨基化反应(2)转氨酶(AT)催化的转氨反应(3)谷氨酸合成酶(GS)催化的反应第二章谷氨酸发酵机制二、谷氨酸生物合成的理想途径由葡萄糖发酵生成谷氨酸的理想途径如下第二章谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵的代谢途径如下图所示第二章谷氨酸发酵机制黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调节机制如下图所示第二章谷氨酸发酵机制三、谷氨酸生产菌的育种思路第二章谷氨酸发酵机制1.切断或减弱支路代谢2.解除自身的反馈抑制3.增加前体物的合成4.提高细胞膜的渗透性5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株谷氨酸生产菌的具体育种思路第二章谷氨酸发酵机制在谷氨酸发酵时,糖酵解经过EMP及HMP两个途径进行,生物素充足菌HMP所占比例是38%,控制生物素亚适量的结果,发酵产酸期,EMP所占的比例更大,HMP所占比例约为26%。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径中的主要过程至少有16步酶促反应。在糖质原料发酵法生产谷氨酸时,应尽量控制通过CO2固定反应供给四碳二羧酸;在谷氨酸发酵的菌体生长期,需要异柠檬酸裂解酶反应,走乙醛酸循环途径。菌体生长期之后,进入谷氨酸生成期,最好没有异柠檬酸裂解酶反应,封闭乙醛酸循环。在生长之后,理想的发酵按如下反应进行:C6H12O6+NH3+1.5O2──C6H9O4N+CO2+3H2O理论收率为81.7%。四碳二羧酸是100%通过CO2固定反应供给。若通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸,则理论收率仅为54.4%,实际收率处于中间值。四、谷氨酸发酵的代谢途径第二章谷氨酸发酵机制第二节谷氨酸生物合成的调节机制一、优先合成与反馈调节二、糖代谢的调节三、氮代谢的调节四、其它调节第二章谷氨酸发酵机制第三节谷氨酸发酵中如何控制细胞膜的渗透性一、控制细胞膜渗透性的方法１.化学控制方法2.物理控制方法二、强制发酵控制工艺第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第一节谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。1.棒状杆菌属(Corynebacterium)2.短杆菌属(Brevibacterium)3.小杆菌属(Microbacterium)4.节杆菌属(Arthrobacterium)第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第二节国内谷氨酸生产菌及其比较一、北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征二、钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征三、天津短杆菌(T6-13)的形态和生理特征四、北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较五、天津短杆菌(T6-13)与钝齿杆菌(B9)的比较六、目前味精行业采用的主要菌株S9114华南理工大学FD415上海复旦大学TG961天津科技大学第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第三节谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化一、种子的菌体形态斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮,革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状,有的微呈弯曲状,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈单个、成对及V字形,有栅状或不规则聚块;分裂的细胞大小为0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足,繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态.三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态发酵前期感染噬菌体后,菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏Ｖ字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起,几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片。第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第四节谷氨酸发酵的代谢控制育种一、日常菌种工作二、选育耐高渗透压菌种三、选育不分解利用谷氨酸的突变株四、选育细胞膜渗透性好的突变株五、选育强化CO2固定反应的突变株六、选育减弱乙醛酸循环的突变株七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到α-酮戊二酸代谢的突变株八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株九、强化能量代谢十、选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第五节应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌一、应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌二、应用转化法选育谷氨酸生产菌三、应用转导法选育谷氨酸生产菌四、应用重组DNA技术构建谷氨酸工程菌五、应用固定化细胞技术发酵生产谷氨酸第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养第六节菌种的扩大培养和种子的质量要求斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵罐种子培养过程第四章谷氨酸发酵控制第一节发酵培养基一、碳源目前所发现的谷氨酸产生菌均不能利用淀粉,只能利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等,有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃等作碳源。二、氮源无机氮源:(1)尿素(2)液氮(3)碳酸氢铵有机氮源:主要是蛋白质、胨、氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液和糖蜜等。三、无机盐(1)磷酸盐(2)硫酸镁(3)钾盐(4)微量元素四、生长因子(1)生物素(2)维生素B1第四章谷氨酸发酵控制第二节温度对谷氨酸发酵的影响温度对谷氨酸发酵的影响是多方面的。从酶反应动力学来看,温度升高,反应速度加快,产物生成速度提前。酶是蛋白质，收热容易失活，温度愈高失活愈快,菌体易衰老,影响发酵液的性质来间接影响发酵,影响基质和氧的溶解从而影响发酵。温度影响细胞中酶的活性,而影响代谢途径方向。各种微生物在一定条件下,都有一个最适的生长温度范围。谷氨酸产生菌的最适生长温度为30～40℃,产生谷氨酸的最适为35～37℃。若温度过高,菌体容易衰老。生产上表现为OD值增长慢,pH值高,耗糖慢,发酵周期长,谷氨酸生成少。应及时降温,采用小通风,流加尿素以少量多次;必要是时可补加玉米浆,以促进生长。适当提高温度可加快发酵速率。第四章谷氨酸发酵控制第三节pH值对谷氨酸发酵的影响一、pH值对谷氨酸发酵的影响二、发酵过程pH值的变化及控制第四章谷氨酸发酵控制第四节供氧对谷氨酸发酵的影响一、溶解氧与谷氨酸的需氧量二、供氧对谷氨酸发酵的影响三、供氧与其他发酵工艺条件的关系四、氧对发酵影响的微生物生理学考察第四章谷氨酸发酵控制第五节泡沫的消除一、泡沫对发酵的影响二、泡沫的形成和性质三、发酵过程泡沫形成的规律四、泡沫的消除第四章谷氨酸发酵控制第六节发酵过程主要变化及中间代谢控制1.适应期2.对数生长期3.转化期4.产酸期谷氨酸的发酵过程曲线第四章谷氨酸发酵控制第七节异常发酵现象及其处理一、常见的异常发酵现象及其处理方法序异常现象原因分析处理方法10时pH值高(1)初尿过多(2)尿素灭菌温度过高、时间过长停搅拌,小通风,待菌体生长,pH下降后再按正常发酵进行2发酵前期pH值过高(1)初尿过多(2)菌种被烧死(3)种子感染噬菌体(4)培养基缺乏或抑制菌体生长(1)按第1项方法处理(2)补种(3)按感染噬菌体处理(4)根据情况补料,补种(5)均先停搅拌、小通风3菌体生长缓慢或不长(1)感染噬菌体(2)培养基贫乏(3)菌种老化(4)前期风量过大,或初尿过多抑制生长(1)按感染噬菌体处理(2)补料,并停搅拌(3)换种、补种(4)停搅拌、小通风4中后期耗糖慢、产酸低(1)菌种老化(2)前期风量过大后期无力(3)种子或发酵前期温度过高(4)生物素不足(1)略减风量,如残糖高可补种,或并罐发酵(2)略减风量,如残糖高可补种,或并罐发酵(3)略减风量,如残糖高可补种,或并罐发酵(4)补料514h后OD值继上升(1)生物素过量(2)染菌(1)提高风量,提高温度(2)按染菌处理第七节异常发酵现象及其处理6耗糖快,pH偏低,产酸低(1)培养基丰富,生物素过量(2)pH低,流尿不及时(3)通风不足,空气短路,搅拌转速低(4)感染杂菌(1)提高风量,提高pH(2)及时流尿,提高pH(3)提高风量,提高pH(4)按染菌处理7发酵液变红色生物素充足,风量不足提高风量8谷氨酸生成后又下跌(1)pH偏低,NH4+过量,谷氨酸转变为谷酰胺(2)大量下跌,可能染菌(1)及时流尿,提高pH(2)按染菌处理9泡沫太多(1)水解糖质量不好(2)染菌(1)改进水解糖质量(2)按染菌处理第七节异常发酵现象及其处理第四章谷氨酸发酵控制第八节发展方向改进发酵工艺1.一次高浓度糖发酵2.降低发酵初糖浓度,连续流加糖发酵3.混合碳源发酵4.应用电子计算机控制和管理发酵,使发酵工艺最佳化5.固定化活细胞连续发酵生产谷氨酸第五章噬菌体与杂菌的防治第一节谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治噬菌体对谷氨酸发酵的危害,轻则减产,重则会引起发酵液全部倒弃,造成严重埙失。谷氨酸生产菌的噬菌体,一般在25-35℃、pH5-9时较为稳定,易受热变性（60-70℃,10-15min),对氧化物敏感,可被酸碱致死。凡能引起蛋白质变性的化学药品都可以使噬菌体失活。第五章噬菌体与杂菌的防治第二节噬菌体浸染的异常现象与严重污染的早期预报1.噬菌体