质粒DNA提取

口腔快检基因检测科研服务健康管理广东爱苏生物科技有限公司质粒DNA提取生物实验培训系列之七生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的定义质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。4生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的定义大部分的质粒都是环状构型。1984年，在放线菌中发现线形质粒。存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。5生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。1.1质粒的定义生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物抗药性质粒*葡萄球菌属3.产细菌素和抗生素质粒梭菌属4.具生理功能的质粒①利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮等肠道细菌②降解辛烷、樟脑、萘、水杨酸等假单胞菌属③产生色素Erwinia(欧文氏菌)④结瘤和共生固氮根瘤菌属5.产毒质粒①外毒素，K抗原(荚膜抗原)，内毒素Escherichiacoli②致瘤根癌土壤杆菌③引起龋齿变异链球菌④产凝固酶、溶血素、溶血纤维蛋白酶和肠毒素金黄色葡萄球菌*抗各种抗生素，抗重金属离子(汞，镉，镍，钴，锌，砷)生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒、载体的特点2.质粒的构建3.质粒的应用质粒基础知识一目录提取方法及条件三提取流程四常见问题解答五质粒的构建及应用二生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的特点①质粒具有自我复制的能力。②质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。③质粒可自行丢失与消除。④质粒的转移性。⑤质粒可分为相容性与不相容性两种。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物载体的特点①具有复制起点。②携带易于筛选的选择标记。③具备合适的酶切位点。④具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的构建（分离目的基因）（切割目的基因和载体）（连接目的基因和载体）（转化宿主细胞）（筛选标记基因）（表达目的基因）（DNA分子克隆）生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的应用运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。例：王丽群，孟祥晨.双歧杆菌质粒载体的研究与应用[J].中国乳品工业,2008,36(8):44-50.生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物片段，是最简单的载体。例如：pBR322质粒载体，pUC18,pUC19,pGEM-3Z/4Z….例：樊颖伦，赵开军等.大片段克隆载体研究进展[J].中国生物工程杂志,2004,24(3):12-15.添加了强启动子，及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件，用于生产蛋白质。例：杜旻，吴晓俊等.发根农杆菌Ri质粒及其在植物基因工程中的应用[J].药物生物技术,2005,12(3):193-196.生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物质粒的应用目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因Tcr6.5kb拷贝数20~30大肠杆菌内毒素标记基因E1COlE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染1.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.加CsCl和溴乙锭4.超速离心过夜5.在紫外灯下吸取cccDNA6.稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间1.用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.沸水浴40秒钟4.离心，用无菌牙签挑去沉淀物5.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物纯度底、快速、操作简便生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物（BufferP1）溶液P2（BufferP2）溶液P5（BufferP5）漂洗液PWT（BufferPWT）洗脱缓冲液TB（BufferTB）RnaseA(10mg/mL)TIANRed吸附柱CP3（SpinColumnsCP3)收集管（CollectionTubes2mL)生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物耗材各种规格枪头、移液枪PCR管1.5mLEP管PCR板双面板生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物，pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体，SuperCOS，pWE15高拷贝1-4mL6-24μgpTZ，pUC,pBS,pGM-T生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物菌液收集菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。取1-4mL菌液，加入离心管中12000rpm，离心1min吸除上清123生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物，重悬向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1使用移液器或涡旋振荡器重悬12加入P1前检查是否已加入RNaseA和TIANRed。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。TIANRed试剂的加入对于后续PCR、酶切和测序都没有影响。使用时按照TIANRed:溶液P1=1:200进行混合，彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。由于使用了TIANRed，添加溶液P2彻底混匀后，溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫色中混杂有混杂的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物去除蛋白质、多糖向离心管中加入350μL溶液P51立即快速上下颠倒混匀12-20次，充分混匀。2出现絮状沉淀。12000rpm，离心2min3加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。上清中含有少量微小白色沉淀对后续实验没有任何影响。如果上清中存在大量微小白色沉淀，可再次离心后取上清。由于使用了TIANRed，添加溶液P5彻底混匀后，溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物中（吸附柱放入收集管中）1注意尽量不要吸沉淀，12000rpm，离心30sec2倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中3生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物，离心30sec2倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中312000rpm，离心1min4倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入干净的离心管中5第二次离心的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物，离心30sec2将质粒溶液收集到离心管中3洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物琼脂糖凝胶电泳原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1、电荷效应利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。2、分子筛效应不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物琼脂糖凝胶电泳不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围琼脂糖浓度（％）DNA有效分离范围（Kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.53～0.2生物实验培训理论学习课堂演示一对一带教个人实操爱苏生物琼脂